雄激素受体剪切变异体7在前列腺癌去势抵抗中的实验研究

摘要

目的：
　　1、建立耐Enzalutamide前列腺癌ENZ-R-LNCaP细胞模型，并验证雄激素受体剪切变异体7（AR-V7）在ENZ-R-LNCaP细胞的表达。
　　2、免疫组化验证AR-V7在低、中、高危前列腺癌标本中的表达情况。
　　方法：
　　1、于含活性炭/葡聚糖处理过的胎牛血清培养基培养前列腺癌LNCaP细胞，其中加入0.1、0.3、1.0uM三个不同浓度二代雄激素受体拮抗剂Enzalutamide（MDV3100），进行连续传代培养，建立耐Enzalutamide的ENZ-R-LNCaP细胞模型，倒置显微镜下观察LNCaP细胞在无雄激素下的生长状态以及其形态的变化，并运用westernblot技术检测前列腺癌LNCaP细胞AR-FL及AR-V7蛋白表达变化。
　　2、根据2015年欧洲泌尿外科学会(EuropeanAssociationOfUrology，EUA)标准，收集南昌大学第一附属医院泌尿外科前列腺癌术后临床组织标本40例，其中低危10例，中、高危组各15例，运用免疫组化染色方法，分别检测在不同危险度前列腺癌标本AR-V7蛋白的表达。
　　结果：
　　1、LNCaP细胞在活性炭/葡聚糖处理过的胎牛血清培养液+Enzalutamide中，初期（3代）生长受到明显抑制，表现为细胞难以贴壁，出现大量细胞死亡，仅少数存活，开始向周围伸出突起；约传至9代后可见细胞逐渐向周围伸出较多突起，并相互联系成网状，细胞呈自分泌状态；当继续培养到12代时，细胞不再呈自分泌状态，随着细胞继续传代培养4个月后LNCaP细胞呈铺开样生长，且细胞状态及形态发生了变化，细胞体积变小，呈圆形或梭形，细胞突触较少。
　　2、westernblot检测AR-FL和AR-V7：加0.1,0.3,1.0uMEnzalutamide（MDV3100）的三个实验组与未加Enzalutamide组比较，AR-V7蛋白表达呈显著上调（P＜0.05），且在不同剂量下表达差异明显（P＜0.05）。
　　3、免疫组化显示：结果示AR-V7绝大多数表达于细胞核内，仅少量表达于胞质中；40例前列腺癌标本AR-V7有19例阳性表达，总阳性表达率47.5％（19/40），其中低危阳性表达为20%（2/10）、中危阳性表达40%（6/15）及高危阳性表达73.3%(11/15)，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1、在含活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清培养液中加入雄激素受体阻断剂Enzalutamide，对前列腺癌细胞LNCaP进行连续传代培养，可建立耐Enzalutamide的ENZ-R-LNCaP细胞模型。
　　2、AR-V7的表达量可能与前列腺癌危险因素等级相关，并可能与前列腺癌去势抵抗的发生、进展密切相关。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞株来源

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器与设备

2.2 实验方法与步骤

2.2.1 耐Enzalutamide前列腺癌ENZ-R-LNCaP细胞建立

2.2.2Western blot检测各组全长雄激素受体（AR-FL）及雄激素受体剪切变异体7（AR-V7）蛋白质表达水平

2.2.3 前列腺癌临床标本AR-V7免疫组化

2.3 统计学处理

第3章 结果

3.1 ENZ-R-LNCaP前列腺癌细胞模型的建立：

3.2 western blot检测不同剂量条件下AR-FL和AR-V7蛋白表达：

3.3 免疫组化AR-V7在前列腺癌的表达情况：

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

综述:雄激素受体（AR）及其剪切变异体（AR-Vs）研究进展