沉默NOL3基因对前列腺癌细胞浸润性发展及凋亡分子机制的研究

摘要

目的:
　　使用Rt2ProfilerPCRArray基因芯片技术检测PCA与BPH组织中基因表达的差异性，使用shRNA干扰技术靶向沉默NOL3基因在前列腺癌细胞株中的表达情况，观察癌细胞株生物学行为改变，并探讨NOL3基因在前列腺癌细胞凋亡过程中的具体分子机制。
　　方法:
　　1.收集前列腺肿瘤及良性前列腺增生的组织，使用Rt2ProfilerPCRArray基因芯片检测技术检测PCA与BPH组织中基因表达的差异性，并使用RT-PCR技术对其中差异性表达较大的存在交互关系网络的基因进行进一步验证。
　　2.构建沉默NOL3基因的慢病毒，PL/shRNA/GFP-homo-NOL3-341转染前列腺癌细胞株（PC3及DU145），为转染组；转染对酯体为阴性对照组；未处理组为空白组。通过荧光显微镜观察前列腺癌细胞株慢病毒的转染效率，qRT-PCR检测NOL3基因的表达效果，MTT法检测转染后24h、48h、72h后，PC3及DU145细胞增殖情况；Transwell小室法检测转染肿瘤细胞侵袭力变化情况；Westernblot法检测NOL3基因蛋白的表达情况，流式细胞仪检测转染后PC3及DU145细胞凋亡的影响情况，Caspase8/9活性检测试剂盒检测沉默NOL3基因后细胞中Caspase8/9酶活性改变。
　　结果:
　　1．使用Rt2ProfilerPCRArray基因芯片检测技术检测PCa与BPH组织中肿瘤相关基因，我们发现AASDHPPT、CASP2、CASP8、CFLAR、CSNK2A1、EHD1、EHD4、NIF3L1、NOL3、SIRPA、TFPT以及VASP共计12个基因存在表达差异性。
　　2．PL/shRNA/GFP-homo-NOL3转染至PC3和DU145细胞的效率分别为90％和80%。转染后，PC3和DU145细胞中NOL3基因的表达水平明显低于阴性对照组和空白组（P＜0.05）；转染组PC3和DU145细胞增殖的抑制率明显高于其他两组（P＜0.05），且呈时间依赖性；转染组PC3及DU145细胞侵袭力明显低于阴性对照组和空白组（P＜0.05）；转染组前列腺癌细胞株中表达NOL3蛋白的水平显著低于阴性对照组和空白组（P＜0.05）；caspase-8及caspase-9活化水平明显高于阴性组和空白组（P＜0.05）；转染组PC3和DU145细胞的凋亡率明显高于阴性对照组和空白组（P＜0.05）。
　　结论：
　　1．Rt2ProfilerPCRArray基因芯片检测技术能够有效地筛选出与前列腺癌发生、发展及转移相关的关键基因；
　　2.前列腺癌的发生、发展及转移过程是由多基因、多因素共同调控相互作用完成的，并非由单一因素所致；
　　3．NOL3基因能够抑制肿瘤细胞的凋亡，靶向沉默NOL3基因并抑制其表达，可显著降低前列腺肿瘤细胞的增殖、侵袭力以及抗凋亡能力。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料和方法

2.1 实验材料

2 .1 .1 组织标本

2.1.2 细胞来源

2.2 主要仪器和试剂

2 .2 .1 主要仪器

2 .2 .2 主要试剂

2 .2 .3 试剂配置：

2.3 实验方法

2 .3 .1 前列腺癌组织中基因表达差异性检测

2.3.2 PCa/BPH的鉴定及分离

2.3.3 Rt2 Profiler PCRArray检测前列腺癌信号通路基因的差异性表达

2.3.4 qRT-PCR检测 PCa与 BPH组织中关联基因的表达差异

2.4 靶向沉默NOL3基因对前列腺肿瘤细胞的影响

2 .4 .1 细胞培养

2 .4 .2 细胞转染

2.4.3 转染 48h后，qRT-PCR检测前列腺癌细胞NOL3的 mRNA表达

2.4.4 转染 48h后，western blot检测NOL3的蛋白表达

2.4.5 MTT检测细胞生长增殖情况

2.4.6 Transwell检测细胞侵袭力的改变

2.4.7 caspase-8/9荧光检测试剂盒检测caspsase-8/9蛋白的表达情况

2.4.8 流式细胞仪检测前列腺肿瘤细胞凋亡情况

2.5 统计方法

第3章 结果

3.1 Rt2 Profiler PCR Array检测前列腺癌信号通路基因差异性表达

3 .1 .1 荧光定量P CR扩增结果

3.1.2 PCR Array数据分析

3.1.3 GNCPro分析软件模拟基因交互关系

3.2 9个关联基因在前列腺癌及良性前列腺增生组织中的表达量

3.3 靶向沉默NOL3基因对PCa细胞株的影响

3 .3 .1 慢病毒转染效率

3.3.2 PL/shRNA/GFP-homo-NOL3转染后抑制前列腺癌PC3和DU145细胞中 NOL3的表达

3.3.3 PL/shRNA/GFP-homo-NOL3 转染后抑制前列腺癌 PC3和 DU145细胞中NOL3蛋白的表达

3 .3 .4 下调 NOL3的表达可抑制前列腺癌PC3和 DU1 4 5细胞的增殖

3 .3 .5 抑制 NOL3的表达可降低前列腺癌PC3和 DU1 4 5细胞的侵袭力

3.3.6 抑制 NOL3的表达可提高Caspase-8及 Caspase-9的活化程度

3 .3 .7 抑制 NOL3的表达可促进前列腺癌PC3和 DU1 4 5细胞发生凋亡

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附图

综述:Caspase调控细胞凋亡的机制研究