AMPK活化对肿瘤生物学行为和抗肿瘤治疗的作用

摘要

背景和目的：全球癌症死亡人数正在迅猛上升，癌症已成为我国五大致死性疾病之首，严重威胁着我国人民的健康水平。能量代谢的相对平衡是抑制肿瘤细胞过度生长的预防机制，而肿瘤细胞依靠代谢重组（如 Warburg效应）获取能量，克服能量供应危机。因此，肿瘤细胞的能量代谢途径已成为肿瘤治疗的潜在靶点。
　　细胞的能量代谢受多条信号通路的调控，其中单磷酸腺苷激酶（AMPK）信号通路是最重要的途径，该通路参与调节Warburg效应，脂肪酸的合成与谷氨酰胺代谢，并与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及多种转录因子有相互作用，共同调节细胞的增殖、生长、凋亡等细胞生物学行为，发挥抑癌作用。肿瘤发生早期，AMPKα1基因的缺失对癌基因诱发的肿瘤有促进作用，有临床病理资料显示肿瘤组织中AMPK活性低于正常组织，AMPK活性不足被认为是恶性肿瘤发生发展的原因之一。
　　鉴于多种恶性肿瘤组织中AMPK的失活，众多学者探索如何利用化学或生物分子激活 AMPK以抑制肿瘤生长，并取得良好的效果。例如，二甲双胍、AICAR、A769662、阿斯匹林、水杨酸，黄莲素等化学药物，其中关于降血糖药物二甲双胍的研究最为突出，现已作为抗癌辅助用药进入临床试验。除了化学药物，还发现一些细胞因子和应激压力也能激活AMPK。
　　各种因素激活AMPK方式不尽相同，但AMPK的充分激活都有赖于AMPK激酶(AMPKK)的参与，目前已证实的AMPKK包括：LKB1、CaMKKβ、TAK1等。LKB1作为 AMPK最重要的上游激酶，在各种肿瘤组织中表达不一，对二甲双胍等AMPK激活剂的抗癌效果有重要影响，但目前对于LKB1在应激压力激活AMPK的作用尚不清楚。此外，前期研究还发现某些应激压力（细胞因子刺激或化疗药物）激活AMPK的过程中，并未涉及以上AMPKK。例如，可诱导渗透压改变的山梨醇。这些应激压力不仅诱导肿瘤细胞的凋亡，还可以引起AMPK活化，但其具体机制尚不清楚。
　　由此可见，为了提高肿瘤细胞中AMPK的活性，不仅有必要对LKB1-AMPK途径进行深入研究，还要探索其他的AMPK激活途径及其在抗肿瘤治疗的作用。因此进行了以下研究：⑴胃癌及肺癌组织中的p-AMPK和LKB1的表达情况；⑵LKB1过表达对胃癌细胞SGC-7901生物学行为的影响；⑶ATM和LKB1在抗癌药物依托泊苷激活AMPK中的作用；⑷AMPK活化是否增加肿瘤细胞对依托泊苷的药物敏感性；⑸LKB1和MLK3对AMPK的调节作用。
　　材料与方法：
　　1.本课题的临床标本来自南昌大学第一附属医院手术切除标本(伦理批准号2014〔025〕)，收集60例胃癌及其对应癌旁组织，采用免疫组化染色分析检测胃癌及癌旁组织p-AMPK（Thr172）及LKB1的表达水平；另外，收集了65例不同阶段的肺腺癌标本，采用免疫组化染色分析不同阶段的肺腺癌组织p-AMPK（Thr172）表达水平；
　　2.在缺乏LKB1蛋白的SGC-7901细胞株中转入功能性野生型LKB1基因，构建稳定表达LKB1的细胞株。以MTT法检测细胞生长和存活，以细胞划痕实验检测细胞迁移，以流式细胞技术检测细胞周期、CD44阳性表达细胞比例、细胞凋亡比率；
　　3.依托泊苷以浓度依赖或时间依赖的方式作用于前列腺癌细胞C4-2后，收集蛋白，以免疫印迹法检测AMPK、ATM磷酸化水平；另外，siRNA干扰C4-2细胞中的ATM或LKB1，再给依托泊苷刺激后，检测AMPK、ATM的磷酸化水平。
　　4.转入AMPK DN突变体到C4-2细胞抑制AMPK活化（C4-2 DN），以空载体为对照（C4-2 E），给依托泊苷刺激24小时，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况；选择AMPK活性不同（C4-2 DN及C4-2 E）细胞和LKB1表达不同（A549 E及A549-LKB1）的细胞，给予依托泊苷刺激不同时间后，以免疫印迹法检测凋亡蛋白表达（Cleaved Caspase3\Cleaved PARP）。
　　5.选择LKB1表达不同（A549及A549-LKB1）细胞，给予各种应激因子刺激后，以免疫印迹技术检测p-AMPK与p-JNK，筛选出同时激活AMPK与JNK的因子；在HEK-293T细胞中转入MLK3质粒，后检测AMPK的磷酸化水平；以GSH纯化技术，获得基因重组蛋白MLK3和AMPK，以体外酶学实验检测MLK3对AMPK的磷酸化；在HEK-293T细胞中，转入MLK3质粒后，用GSH beads将GST-MLK3蛋白捕获，以免疫印迹检测沉淀中是否捕获内源性AMPKα1或AMPKα2蛋白；将Myc-AMPK?1或?2和GST-MLK3质粒共转染HEK-293T细胞，收集细胞裂解液，与GSH Beads孵育，离心沉淀，收集GSH Beads-MLK3和捕获的蛋白，以anti-GST和anti-Myc抗体进行免疫印迹分析。
　　结果:
　　1.胃癌及肺癌组织中AMPK和LKB1情况
　　⑴免疫组化结果显示胃癌组织p-AMPK（Thr172）、LKB1的表达低于癌旁组织(p<0.001)。p-AMPK（Thr172）表达：胃癌中（-）20例，（+）33例，（++）6例，（+++）1例，而癌旁组织中：（-）5例，（+）11例，（++）28例，（+++）16例。LKB1表达：胃癌中（-）23例，（+）25例，（++）12例，（+++）0例，癌旁组织中LKB1表达：（-）9例，（+）13例，（++）27，（+++）11例。
　　⑵不同分期肺癌组织中的AMPK活化情况，随着肺腺癌分期的恶性程度增高，p-AMPK（Thr172）表达渐渐下降，Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期(Spearman相关分析=-0.397, p<0.05)。Ⅰ期（-）4例，Ⅰ期（+）5例，Ⅰ期（++）10例，Ⅰ期（+++）3例;Ⅱ期（-）5例，Ⅱ期（+）10例，Ⅱ期（++）9例，Ⅱ期（+++）3例;Ⅲ期（-）9例，Ⅲ期（+）8例，Ⅲ期（++）1例，Ⅲ期（+++）0例。
　　2.提高LKB1蛋白表达对胃癌细胞SGC-7901生物学行为的影响
　　在缺乏LKB1的肿瘤细胞SGC-7901中转入LKB1基因，增加LKB1的表达可以抑制细胞的增殖与迁移，减少CD44阳性细胞的比例，提高肿瘤细胞对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和伊立替康三种抗癌药物敏感性。
　　3. ATM和LKB1在依托泊苷激活AMPK中的作用
　　⑴Western Blot结果显示：肿瘤细胞A549受依托泊苷刺激后，p-ATM和p-AMPK（Thr172）逐渐上升，并呈剂量和时间依赖性；
　　⑵siRNA干扰C4-2细胞的ATM表达后，ATM表达下调，给予依托泊苷刺激细胞，Western Blot结果显示：p-ATM和p-AMPK（Thr172）无明显上升；而对照组ATM表达正常，提示依托泊苷刺激可以同时激活ATM和AMPK,依托泊苷激活AMPK过程中需要ATM的参与。
　　⑶siRNA干扰C4-2细胞的LKB1表达，LKB1表达下降，给予依托泊苷刺激细胞，Western Blot结果显示：p-ATM表达逐渐上升，而无法激活AMPK；而对照组LKB1表达正常，依托泊苷刺激可以同时激活ATM和AMPK。提示在缺乏LKB1的条件下，依托泊苷可以激活ATM，但无法激活AMPK。
　　⑷在缺乏LKB1的A549细胞中，转入LKB1基因，提高LKB1蛋白表达后，给予依托泊苷刺激细胞，Western Blot结果显示：可以同时激活ATM和AMPK；而对照组LKB1表达无变化，依托泊苷刺激p-ATM表达逐渐上升，而无法激活AMPK。
　　以上结果提示：依托泊苷激活AMPK过程中需要ATM和LKB1共同参与。
　　4. AMPK活化对肿瘤细胞药物敏感性的影响
　　⑴流式细胞分析显示，在依托泊苷刺激下C4-2E细胞（AMPK有活性）凋亡细胞的比例明显高于C4-2 DN（AMPK无活性）；
　　⑵依托泊苷刺激后，C4-2 E细胞中的p-AMPK（Thr172）表达、Cleaved Caspase3表达和Cleaved PARP表达明显高于C4-2 DN细胞；
　　⑶依托泊苷刺激下，A549-LKB1细胞的p-AMPK（Thr172）表达、Cleaved Caspase3表达和Cleaved PARP表达明显高于对照组（A549 E）。
　　结果提示，AMPK活化或提高LKB1表达有助于增强肿瘤细胞的药物敏感性。
　　5. MLK3对AMPK的调节作用
　　⑴A549-LKB1和A549-WT细胞受山梨醇、AICAR等7种因子刺激，仅在山梨醇所刺激A549-LKB1和A549-WT两种细胞后，p-AMPK和p-JNK都升高；提示山梨醇可以同时激活AMPK和JNK,并不依赖于LKB1。
　　⑵A549-LKB1和A549-WT细胞受山梨醇刺激，两细胞的p-AMPK同时升高，提示山梨醇可能以不依赖LKB1的方式激活AMPK；
　　⑶在HEK293T细胞中转入MLK3质粒，过表达MLK3蛋白，然后以免疫印迹法检测p-AMPK（Thr172）水平，结果显示MLK3的异常过表达可提高p-AMPK（Thr172）水平。
　　⑷体外激活AMPK酶学实验显示，单独加入AMP或单独加入LKB1蛋白对AMPK的磷酸化无明显影响；同时加入AMP和LKB1可以引起AMPK的磷酸化；单独加入MLK3可以引起明显的AMPK磷酸化；同时加入AMP和MLK3引起的AMPK磷酸化最强。该结果提示MLK3可在缺乏AMP的情况下磷酸化AMPK，说明AMPK是MLK3的催化底物。
　　⑸MLK3与AMPK间的相互结合；通过Pulldown技术发现，转入GST-MLK3质粒的细胞提取物中发现AMPKα1的表达，提示转入表达的MLK3蛋白与细胞内源性AMPKα1亚单位紧密结合；共转染Myc-AMPK?1或?2和GST-MLK3入HEK-293T细胞，然后通过IP技术证明，外源性表达GST-MLK3蛋白能与外源性Myc-AMPK?1蛋白发生特异性结合。
　　结论：
　　1.癌组织中AMPK失活可能是恶性肿瘤发生发展的原因之一，LKB1表达下调可使AMPK失活。在缺乏LKB1表达的肿瘤细胞中，提高LKB1蛋白表达可以抑制细胞的生长、转发移，增强肿瘤细胞的药物敏感性。
　　2.依托泊苷激活AMPK的过程需要ATM和LKB1共同参与；AMPK活化使得肿瘤细胞对依托泊苷诱导凋亡作用更为敏感。
　　3. MLK3能与AMPK?1结合，并以非LKB1方式直接磷酸化AMPK，MLK3有可能是AMPK新的上游激酶。

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中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 概述

1.2 AMPK的基本结构

1.3 AMPK对代谢的调节

1.4 AMPK的抑癌功能

1.5 AMPK的激活

1.6 ATM和MLK3在AMPK活化中的作用

第2章 胃癌及肺癌组织标本中LKB1/p-AMPK的表达水平

2.1 背景

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 LKB1过表达对胃癌细胞SGC-7901生物学行为的影响

3.1 背景

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 ATM和LKB1在依托泊苷激活AMPK中的作用

4.1 背景

4.2 材料与方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第5章 AMPK活化增加肿瘤细胞对依托泊苷的药物敏感性

5.1 背景

5.2 材料与方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

第6章 LKB1和MLK3对AMPK的调节作用

6.1 背景

6.2 材料与方法

6.3 实验结果

6.4 讨论

第7章 结论与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: LKB1/AMPK在抗肿瘤治疗中的作用