IDH1 R132H突变对U87MG细胞增殖抑制作用的体内外研究

摘要

人脑胶质母细胞瘤在中枢神经系统中是一种常见的恶性肿瘤，患者中位生存期较短，5年的生存率仅仅为20％～30％，并且近年来胶质母细胞瘤的发病率仍然呈上升的趋势[1]。治疗上目前仍然以手术为主，但由于肿瘤呈浸润性生长，恶性程度较高，与正常脑组织之间没有明显界限，除肿瘤处于早期，大小较小且位于适当部位者外，其他难以作到全部切除，术后配合以放射治疗、化学治疗等，可延缓复发及延长生存期，但整体疗效仍不理想[2]。因此，研究胶质瘤的发生及其发展机制，探寻胶质瘤综合治疗的新策略和新靶点，已经成为胶质瘤研究领域中一项非常重要的内容。
　　随着肿瘤分子机制研究地不断深入，人们在胶质瘤的发生发展中发现了越来越多的分子异常，有学者利用高通量测序技术，筛查了22例多型性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），在其相关基因突变情况中发现有5例胶质母细胞瘤患者存在异柠檬酸脱氢酶-1（Isocitrate dehydrogenases-1，IDH1）突变，后续的实验又发现了127例胶质母细胞瘤患者中有13例患者存在IDH1基因点突变，突变率达到了12%，这些突变尤其好发于继发性胶质母细胞瘤，发病相对较早，预后较好[3]。其中R132H型突变占了86.9%[4]，其在胶质瘤的发生发展中起着重要的作用。
　　异柠檬酸脱氢酶（IDH）是一种由普遍存在于真核生物和人类中的异柠檬酸脱氢酶基因所编码的蛋白酶，具有氧化异柠檬酸成为草酰琥珀酸的功能，然后进行脱羧作用进而生成ɑ-酮戊二酸（ɑ-ketoglutarate,ɑ-KG）。IDH1基因在染色体中定位于2q33，编码蛋白位于过氧化物酶体和胞浆内，研究表明，IDH1具有帮助机体抵御单态氧、γ-射线、UVB射线，强化葡萄糖诱导胰岛素分泌过程等功能。肿瘤源性IDH1突变导致其丧失正常活性，获得的新变体活性，将α-KG还原成2-HG(2- hydroxy glutaric acid)。2-HG与α-KG在结构上相似，对α-KG具有拮抗作用，竞争性抑制α-KG依赖的双加氧酶，IDH突变和2-HG所引起的表观遗传调控改变被视作是发挥其致癌效应的主要机制。IDH1在不同类型脑胶质瘤有着不同突变率的分布，根据其不同的分布，如果按照病理形态学进行分类比较困难时，可以结合相关IDH1突变检测，对级别为WHOⅡ级的脑胶质瘤或者是毛细胞星形细胞瘤以及室管膜瘤、原发性以及继发性胶质母细胞瘤进行鉴别。IDH1突变主要发生在较年轻的患者，无论有怎样的类型、级别都会有较好的预后。IDH1基因突变有可能成为用于胶质瘤辅助诊断和预后好坏判断的一种新的标志物，目前，用于脑胶质瘤检测方法相对来说还比较落后，其灵敏度不高，特异性不够强，操作比较复杂、价格昂贵。目前仍然存在一个难题，获得IDH1突变的脑胶质瘤细胞，不能够在标准培养条件下稳定传代，仍然没有建立一个具有IDH1突变的稳定的脑胶质瘤细胞系，为今后进一步关于胶质瘤方面的的研究造成了障碍。IDH1基因突变研究的突破点可能在代谢与肿瘤的发生以及发展关系上，为今后脑胶质瘤的个体化治疗以及生物治疗提供新靶点。
　　前期研究工作提示 IDH1基因在胶质母细胞瘤中突变率较高，其中又以R132H型为主，存在 IDH1(R132H)突变的胶质瘤患者预后相对较好，故推测IDH1(R132H)可能对胶质瘤细胞产生相关作用，从而导致IDH1(R132H)突变的胶质瘤患者预后相对较好，本研究将在体内外探讨IDH1(R132H)突变对U87MG细胞增殖作用的抑制作用，探寻新的胶质瘤治疗的靶点，为胶质瘤的治疗提供更新的有加全面有效的方法和思路。
　　本课题将分为以下两个部分研究内容：
　　第一部分为IDH1 mut（R132H）对U87MG细胞增殖的影响的体外研究。我们首先通过表达IDH1 mut（R132H）的慢病毒浸染U87MG细胞，利用RT-PCR验证转染效率并通过细胞计数验证其对细胞增殖的影响；通过人为加入 IDH1 mut（R132H）代谢产物2-HG，细胞计数方法验证其对细胞增殖的影响。结果显示RT-PCR验证IDH1 mut（R132H）和IDH1 wt表达于U87MG中；其细胞增殖速度慢于IDH1 wt和空白对照组；2-HG能抑制细胞的增长。
　　第二部分为IDH1 mut（R132H）对U87MG细胞增殖的影响的体内研究。表达IDH1 mut（R132H）的慢病毒浸染胶质瘤细胞后，NOD/SCID小鼠皮下注射建立动物模型，观察肿瘤生长情况，测量并记录，提取肿瘤组织RNA验证IDH1 mut（R132H）在肿瘤组织中的表达，并利用免疫组织化学染色法对肿瘤组织中Ki-67蛋白的表达进行检测。结果显示，动物体内实验再次证实,表达IDH1 mut（R132H）的肿瘤生长速度慢于IDH1 wt，并且组织切片中Ki-67的表达在IDH1 mut（R132H）肿瘤中要少于IDH1 wt。
　　结论：通过体内外的实验研究，我们证实了IDH1 mut（R132H）通过其代谢产物2-HG对U87MG细胞增殖起到了抑制作用。

目录

声明

缩略语/符号说明

第1章 前言

1.1 研究现状、成果

1.2 研究目的、方法

第2章 IDH1 mut（R132H）对U87MG细胞增殖的影响的体外研究

2.1 对象与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第3章 IDH1 mut（R132H）对U87MG细胞增殖的影响的体内研究

3.1 对象与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第4章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:IDH1突变在胶质瘤中的研究进展