微孔化烧伤变性真皮联合脂肪干细胞构建人工复合皮的初步研究

摘要

目的：
　　利用脂肪干细胞（adipose-derived stem cells ADSCs）在体外联合激光微孔化烧伤变性真皮基质（laser micropore denatured dermal matrix LP-DDM）构建人工复合皮，通过观察和分析其生物相容性及移植后血管化等效果，以期获得一种新型复合皮。
　　方法：
　　1、取健康雄性SD大鼠肾周脂肪，体外分离培养ADSCs并进行成脂、成骨分化实验，对ADSCs表面标记物CD29、CD45、CD90进行流式细胞检测；切取 SD大鼠背部深Ⅱ度烧伤创面处全厚皮并进行脱细胞和激光微孔处理得到LP-DDM；将ADSCs种植于LP-DDM上观察细胞的种植情况并构建成人工复合皮；2、取16只雄性健康SD大鼠，随机分为4组，分别设为A组：移植DDM、B组：移植DDM+ADSCs、C组：移植LP-DDM、D组：移植LP-DDM+ADSCs，每只大鼠背部设计1个大小约2cm?2cm的皮瓣，按照分组将材料包埋植入皮下并缝合皮肤，每组分别在包埋移植术后第7天、14天、21天、28天时大体观察移植皮片与周围组织的相容性及血管化情况，并取组织进行 HE染色观察其变化。
　　结果：
　　1、原代培养的ADSCs呈星型或多角形，传代后的ADSCs呈现长梭形，成纤维细胞样、漩涡样生长。ADSCs成脂诱导分化4周后观察到油红O染色后大而圆状脂滴，ADSCs成骨诱导分化4周后观察茜素红染色后的钙沉淀；流式细胞仪检测ADSCs表面标记物结果示CD45阴性表达（0.70％）的同时CD29、CD90阳性表达率为93.4%。ADSCs与LP-DDM共培养发现ADSCs可顺利接种并生长于LP-DDM上，DAPI荧光染色后通过荧光显微镜观察到定植于支架材料上的ADSCs呈现蓝色荧光，并且细胞增长速率与对照组相比无明显差异（P＞0.05），另外通过CCK-8标记后测定OD值，LP-DDM组和DDM组与对照组比较无明显差异（P＞0.05），表明 LP-DDM、DDM并不会造成细胞毒性作用，且细胞增殖复制能力强，细胞活力好。2、动物实验：（1）大体观察：移植术后14天可见A、B、C、D四组少量红色血管组织出现在皮片周围；移植术后28天，肉眼见D组皮片周围形成较多红色血管样组织，较其他3组更为密集，并且与皮下周围组织紧密融合，部分皮片颜色由乳黄色逐渐变为粉红色，并在植入皮片的表面可见散在的小红点。（2）组织学观察（HE染色）：第14天见C、D组皮片周围均出现少量血管浸润现象，A组血管浸润少，4组皮片周边均可见炎性细胞存在。第28天，A组中少量血管浸润，与正常组织相接的边界清晰，B组可见少量血管浸润现象，伴有脂肪样结缔组织，C组见有较多血管浸润，D组可见复合皮边界与内部均出现大量血管浸润，并伴有脂肪样结缔组织生成，镜下见炎症细胞逐渐减少，其边界基本与正常组织相融合。
　　结论：
　　新型人工复合皮移植后发现其生物相容性好，未出现明显的免疫排斥反应，具有加速组织血管化、向脂肪样组织分化的作用，为今后此种复合皮在创面愈合方面的相关研究以及临床应用提供了实验依据。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与研究方法

2.1 主要设备仪器、试剂、实验动物来源

2.2 研究方法

第3章 实验结果

3.1 ADSCs的体外分离培养

3.2 ADSCs表面标记物的检测

3.3 ADSCs成脂化的鉴定

3.4 ADSCs成骨化的鉴定

3.5 人工复合皮的构建

3.6 动物实验

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述:应用脂肪干细胞修复皮肤损伤的研究进展