解淀粉芽孢杆菌与其诱变菌株酶系分析和蛋白酶基因克隆表达

摘要

本论文的主要研究内容包含以下几点：
　　通过培养菌株NCU116与诱变菌株NCU116-1，并对其菌落形态及其在扫描电镜下的形态进行对比，发现菌株诱变前后的菌落形态和细菌形态基本变化不大。菌落呈圆形、外表光滑，颜色为浅黄色、边缘有不规则波状突起。用分析型扫描电子显微镜下观察，菌株形态为杆状，表面光滑，呈钝圆形态，较细长，单个或多个首尾相连排列。结果表明，对于某些菌株，物理化学诱变对其分泌胞外酶的基因产生影响较大，使控制胞外酶性状的DNA发生了一定程度的突变，而对其菌落和细胞形态并无引起较大改变。
　　通过摇瓶培养的方式对菌株NCU116和NCU116-1进行培养，使用国家标准方法、CMC-Na法等对胞外酶进行分析。结果表明菌株胞外酶系包括：蛋白酶、糖化酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶。并确定了各个胞外酶活力与发酵时间的关系及其最佳发酵时间。结果表明：
　　菌株NCU116，摇瓶发酵44h时，菌株所产蛋白酶和淀粉酶活力最高，分别为4536.5U/mL和4.8U/mL；糖化酶的活力最高值（4070.9U/mL）出现在摇瓶38h时；发酵42h时，果胶酶和纤维素酶活力最高，分别为875.3U/mL和57.0U/mL。诱变菌株NCU116-1，摇瓶44h时，菌株所产蛋白酶活力最高，为9027.0U/mL；果胶酶在摇瓶42h活力最高（1944.2U/mL），糖化酶，淀粉酶，纤维素酶在摇瓶40小时活力最高（分别是10727.6U/mL，6.3U/mL和29.2U/mL）。
　　使用国家标准方法、CMC-Na法等对解淀粉芽孢杆菌NCU116与NCU116-1胞外酶系的酶学性质进行分析。结果表明：
　　原始菌株NCU116所产的蛋白酶在50℃下的酶活力最高，其最适作用温度为40-45℃、最适作用pH值为7.0，Mn2+对其有激活作用；糖化酶在45℃下的酶活力最高，其最适作用温度为40-45℃、最适作用pH值为6.0，Ca2+对其有激活作用；果胶酶在40℃下的酶活力最高，其最适作用温度为35-40℃、最适作用pH值为7.0，Ca2+对其有激活作用；纤维素酶在35℃下的酶活力最高，其最适作用温度为35-40℃、最适作用pH值为7.0，Ca2+对其酶活有微弱促进作用。
　　诱变菌株NCU116-1所产蛋白酶在50℃时活力最高，Mn2+对其有激动作用，最适宜酶解温度为40-45℃、适宜酶解pH为8.0；糖化酶在35℃时活力最高，Cu2+对其有激动作用，最适宜酶解温度为35℃左右、适宜酶解pH为8.0；果胶酶在40℃时活力最高，Ca2+对其有激动作用，最适宜酶解温度为35-40℃、适宜酶解pH为6.0；纤维素酶在50℃时活力最高，Cu2+对其有活力有促进作用，最适宜酶解温度为40-45℃，适宜酶解pH为7.0。
　　以解淀粉芽孢杆菌NCU116作为研究对象，对其蛋白酶基因进行了克隆、表达与纯化。通过基因克隆方法，得到了一条长度为1494bp的蛋白酶基因，经Blast序列分析可知，该基因与Bacillus amyloliquefaciens中性蛋白酶基因（Sequence ID: K02497.1）有99％的同源性。蛋白酶目的基因所编码的蛋白理论分子量（Molecular weight）为52.85kDa，等电点pl=8.25，正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）数目为53个，负电荷氨基酸残基（Arg+Lys）数目为51个。不稳定系数（The instability index）为25.93，表明该蛋白稳定性比较好。280nm处消光系数为59710M-1 cm-1。脂肪系数为71.33，总平均亲水性为-0.658。该蛋白是易容，亲水性较强的蛋白。经过软件分析可以看出67-1491序列与Peptidase_M4_C蛋白家族结构域序列一致，具有LasB结构域。预测的启动子序列最有可能在5’端第723和773碱基之间，或者在5’端第865和915碱基之间。并预测出蛋白的二级、三级结构。通过构建异源表达体系，将目的基因转入大肠杆菌中，37℃诱导表达融合蛋白，通过镍琼脂糖亲和层析和凝胶过滤层析，纯化得到0.50mg/mL的蛋白。

目录

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缩略词索引

第1章 绪论

1.1 蛋白酶研究进展

1.2 芽孢杆菌的研究现状

1.3 樟树及樟树籽仁油研究进展

1.4 中碳链脂肪酸甘油酯研究进展

1.5 选题意义及研究内容

第2章 解淀粉芽孢杆菌NCU116与其诱变菌株胞外酶酶学性质的比较分析

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 解淀粉芽孢杆菌NCU116蛋白酶基因的克隆及其序列测定分析

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 解淀粉芽孢杆菌NCU116中性蛋白酶基因的表达与纯化

4.1 材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果