池蝶蚌亲环蛋白D(CypD)基因的表达及对人肝癌细胞(SMMC-7721)生长的影响

摘要

本研究以淡水贝类池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)为研究对象，用HsCypD基因完整的ORF与pGEX-4T1构建重组载体，将重组质粒pGEX-4T1-HsCypD转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，然后进行原核表达，后经小量诱导以确定IPTG浓度及温度等表达条件，成功表达出分子量约为67kDa的GST-HsCypD融合蛋白。利用GST亲和层析获得单一GST-HsCypD融合蛋白后，用凝血酶切除融合蛋白的GST标签，再用GST亲和层析去掉切下的GST标签，从而获得纯度较高的分子量约为41kDa左右的HsCypD蛋白。采用Bradford法用于测定蛋白浓度及含量，将符合抗体制备浓度要求的HsCypD作为抗原来免疫长耳朵兔，制备多克隆抗体。利用ELISA间接法来检测所得抗体的效价，结果效价高达1:1024000。Western blot检测结果表明得到的多克隆抗体不仅能与作为免疫抗原的HsCypD有较好的特异性结合，对于从池蝶蚌中提取的肠、肝以及性腺的组织蛋白，也同样具有较强的特异性结合，说明本研究获得的确实是针对HsCypD特异性结合的抗体，为后续关于HsCypD的生物功能的相关研究提供了实验基础。
　　此后本研究利用HsCypD的抗体，通过免疫荧光定位技术来探究HsCypD在池蝶蚌的肝胰腺细胞和雌性性腺细胞中的位置。结果表明，在这些组织细胞中，HsCypD在细胞质上的荧光强度很明显。为了进一步确定HsCypD在细胞中的显微定位，本研究成功构建pEGFP-C1-HsCypD真核载体，瞬时转染于人肝癌细胞(SMMC-7721)，表达后经过激光共聚焦显微镜观察，结果证实HsCypD在细胞中主要存在于细胞质中。本次蛋白定位同以前关于HsCypD的生物信息学相关分析的结论相一致，我们推测该蛋白主要在细胞质中行使相关的功能。
　　为了检测HsCypD对肝癌细胞(SMMC-7721)生长的影响，将构建好的pcDNA3.1(+)-HsCypD以及pcDNA3.1(+)空载质粒，瞬时转染SMMC-7721细胞。转染24小时后，分别提取未经处理的空白对照组，转染空载的空载对照组，以及实验组的细胞RNA，反转录合成cDNA作为模版，对HsCypD、p53、Bax、Bcl2和Caspase-3基因的表达做实时荧光定量PCR检测。结果表明，相对于空载对照组，HsCypD过表达组中促凋亡基因p53、Bax、Caspase-3均有下调，而抑制凋亡基因Bcl2有大幅度的上调。后用流式细胞仪检测转染了30个小时的三组细胞的凋亡情况，结果表明实验组相对于空载对照组的凋亡率有明显的降低，说明HsCypD的过表达能够减弱pcDNA3.1(+)空载表达造成的细胞凋亡影响，具有一定的抑制细胞凋亡的功能。将pcDNA3.1(+)-HsCypD和pcDNA3.1(+)分别转染SMMC-7721细胞24小时后，加入不同浓度梯度的阿霉素刺激8小时，利用Caspase-3分光光度法检测试剂盒来检测在不同条件下细胞的caspase-3活化程度。结果表明，HsCypD的过量表达能够抑制阿霉素诱导的caspase-3激活，同时随着阿霉素浓度越大，这种抑制作用越明显。综上结果初步预测，HsCypD具有抑制细胞凋亡的生物学功能。

目录

声明

本实验所需的器材及试剂

第一章 引言

1.1 亲环蛋白家族(Cyclophilins)

1.2 CypD的相关研究

1.2.1 CypD和MPTP之间的关系

1.2.2 CypD同其他蛋白的相互作用

1.2.3 CypD在疾病上的作用

1.3 本研究的研究意义和目的

第二章 池蝶蚌CypD的原核表达及组织细胞上的定位

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 池蝶蚌cDNA的合成

2.2.2 原核表达目的片段cDNA的克隆

2.2.3 原核表达重组载体的构建

2.2.4 原核表达重组载体的构建和双酶切鉴定

2.2.5 融合蛋白的原核表达

2.2.6 融合蛋白的纯化

2.2.7 Bradford法测定蛋白浓度

2.2.8 多克隆抗体的制备

2.2.9 多克隆抗体效价的测定

2.2.10 Western blot检测抗体的特异性

2.2.11 HE染色检测切片

2.2.12 免疫荧光定位

2.2.13 构建真核重组质粒的目的片段的获得

2.2.14 pEGFP-C1-HsCypD真核重组质粒的构建及提取

2.2.15 肝癌细胞(SMMC-7721)细胞培养和传代

2.2.16 细胞转染

2.2.17 Western blot检测HsCypD过量表达

2.2.18 激光共聚焦显微镜扫描检测带GFP绿色荧光的SMMC-7721细胞

2.3 结果和分析

2.3.1 总RNA的提取

2.3.2 原核表达目的片段PCR扩增

2.3.3 原核表达PCR产物回收

2.3.4 原核表达重组质粒鉴定

2.3.5 小量诱导结果

2.3.6 超声波破碎后电泳图

2.3.7 融合蛋白的纯化

2.3.8 凝血酶酶切结果

2.3.9 Bradford法测定蛋白浓度

2.3.10 间接ELISA测定多克隆抗血清效价

2.3.11 抗体的Western blot检测

2.3.12 HE染色结果

2.3.13 HsCypD在肝胰腺细胞和卵细胞上的免疫荧光定位分析

2.3.14 真核重组质粒的HsCypD目的片段的扩增

2.3.15 真核重组质粒鉴定

2.3.16 Western blot检测结果真核表达

2.3.17 HsCypD在SMMC-7721肝癌细胞上的定位情况

2.4 讨论

第三章 池蝶蚌CypD对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 PCR 引物设计

3.2.2 pcDNA3.1(+)-HsCypD重组质粒构建及提取

3.2.3 肝癌细胞（SMMC-7721）的细胞培养和传代以及细胞转染

3.2.4 荧光定量PCR检测SMMC-7721相关凋亡基因的表达变化

3.2.5 Western blot检测

3.2.6 流式细胞仪检测

3.2.7 Caspase-3分光光度法检测试剂盒检测Caspase-3的活化程度

3.3 实验结果

3.3.1 对凋亡相关因子的表达量的qReal-time PCR检测

3.3.2 Western blot检测结果

3.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

3.3.4 Caspase-3活性检测

3.4 讨论

第四章 结论和展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间的研究成果