NRSN2活化PI3K/AKT/mTOR通路促进非小细胞肺癌的生长

摘要

目的：
　　非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是世界上最常见的恶性肿瘤，总的5年生存率仅15％，已成为恶性肿瘤首位死亡原因。近年来小分子靶向药物的发展，对NSCLC的治疗产生了重大影响。然而，由于靶点局限性及耐药性等问题，大多数NSCLC病人并没有合适靶向药物可选用。为改变NSCLC的治疗现状，迫切需要寻找新的治疗靶点。
　　神经囊泡膜蛋白 Neurensin-2（NRSN2）是新近发现的基因，编码一种多通道囊泡膜蛋白，主要参与囊泡运输和神经信号传导。针对NRSN2的以往研究主要集中在神经信号传导。近年研究显示NRSN2表达异常与肿瘤发生有关。有趣的是，在肝癌和恶性黑色素瘤的研究中发现，NRSN2承担着截然相反的功能——抑癌和或促癌。我们在检索 Oncomine数据库（基因芯片数据库）中发现NRSN2在NSCLC呈中高表达。研究也表明NSCLC（尤其是肺腺癌）与神经内分泌失调紧密相关。因此，我们推测NRSN2可能与NSCLC密切关联。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信号转导通路是重要的细胞内信号传导通路，它的功能主要是促进细胞的增殖和抗凋亡。PI3K/AKT/mTOR通路的异常激活是NSCLC发生和发展的重要机制，而NRSN2是否参与了PI3K/AKT/mTOR通路的激活还不完全清楚。本研究主要通过过表达或siRNA抑制等方法，探讨NRSN2在NSCLC增殖、侵袭中的作用及分子机制，旨为寻找治疗NSCLC新靶点和研发靶向药物提供理论依据。
　　方法：
　　(1)采用荧光定量 PCR、免疫组化染色、免疫印迹等方法分别从 mRNA及蛋白水平检测NRSN2在NSCLC组织中的表达。统计分析NRSN2表达与NSCLC各临床病理因素间的关系。
　　(2)采用基因重组的方法，利用慢病毒载体构建稳定表达 NRSN2基因的真核细胞载体以及RNAi技术沉默NRSN2基因表达。通过转染A549肺癌细胞株，分别建立NRSN2过表达及低表达（沉默）的肺癌细胞模型。
　　(3) CCK-8法、平板克隆实验、Transwell小室侵袭实验研究过表达和抑制 NRSN2基因表达对A549肺癌细胞的生长、侵袭等生物学行为的影响。
　　(4)免疫印迹检测研究 NRSN2基因过表达和基因沉默后 PI3K/AKT/mTOR通路主要成员AKT及mTOR的磷酸化水平。
　　结果：
　　(1) NRSN2在NSCLC组织中表达升高，且表达水平与肿瘤大小及分化显著正相关
　　与正常肺组织相比，NRSN2在NSCLC组织中表达显著升高（P＜0.01）。免
　　疫化染色提示NRSN2蛋白表达阳性率与肿瘤大小及肿瘤分化密切相关（P＜0.05），但与患者性别、年龄、病理类型、TNM分期等其他临床病理特征无关。
　　(2)沉默NRSN2表达抑制A549肺癌细胞活性及增殖能力
　　采用RNA干扰沉默A549肺癌细胞中NRSN2基因表达。采用CCK-8检测si-NRSN2组与si-NC组细胞活性，结果显示，相比si-NC组si-NRSN2组细胞活性显著减弱（P＜0.01）。平板克隆形成实验也揭示，相比对照组，si-NRSN2组的细胞克隆形成率也显著减弱（P＜0.01）。
　　(3) NRSN2过表达提高A549肺癌细胞活性，促进癌细胞增殖
　　利用慢病毒载体构建NRSN2基因的真核细胞载体感染A549细胞，成功建立稳定过表达 NRSN2的 A549肺癌细胞系。与空载慢病毒质粒感染组（lenti-vector）相比较含 NRSN2基因片段的重组慢病毒质粒感染 A549细胞组（lenti-NRSN2），CCK-8法细胞活性检测显示，lenti-NRSN2组A549细胞活性显著提高（P＜0.01）。平板克隆形成实验也揭示与 lenti-vector组相比，过表达NRSN2的细胞克隆形成率显著升高（P＜0.01）。
　　(4) NRSN2表达水平与肺癌细胞侵袭能力无关
　　Transwell小室迁移实验研究结果发现，外源性增加 NRSN2表达或沉默NRSN2表达，A549肺癌细胞侵袭能力无改变。
　　(5) NRSN2可能活化PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肺癌细胞生长
　　提取各组A549细胞的总蛋白进行免疫印迹实验分析。结果发现沉默NRSN2表达后，AKT及mTOR的磷酸化水平降低；反之，上调NRSN2表达，AKT及mTOR的磷酸化水平升高。
　　结论：
　　NSCLC组织中高水平表达的NRSN2可能激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进NSCLC生长。研究验证了NRSN2具有促癌的功能。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

1 概述

2.1 NRSN2的特征、表达

2.2 NRSN2在细胞中的功能

2.3 NRSN2与肿瘤

3 本课题的研究背景、研究目的和研究内容

第2章 NRNS2在非小细胞肺癌组织及细胞中的表达

1.1组织标本

1.2实验细胞

1.3 主要试剂

1.4 实验主要仪器和设备

1.5 实验方法

2 数据处理

3 实验结果

3.1 基因数据库检索结果

3.2 NRSN2mRNA肺癌组织及癌旁组织中表达

3.3 NRSN2蛋白在肺癌组织及相应癌旁组织中的表达水平

3.4 NRSN2蛋白在3种肺癌细胞株中的表达

3.5 免疫组化检测NRSN2蛋白在肺癌组织及正常肺组织中表达

3.6 NRSN2表达与肺癌各临床因素的相关性

4 讨论

5 本章小结

第3章 NRSN2在非小细胞肺癌中作用及机制

第1节 NRSN2过表达及沉默的肺癌细胞模型建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第2节 NRSN2在NSCLC中生物学功能及作用机制

1 材料与方法

2 数据处理

3. 实验结果

4 讨论

5.小结

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.1.1 NRSN2在NSCLC组织中表达升高，表达量与肿瘤大小及分化有关

4.1.2 上调NRSN2表达水平提高A549肺癌细胞活性及增殖能力

4.1.3 NRSN2表达水平与肺癌细胞侵袭能力无关

4.1.4 NRSN2可能活化PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进肺癌细胞的生长

4.2 进一步工作的方向

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:NRSN2的研究进展

附录