耐碳青霉烯类大肠埃希菌的耐药机制及其同源性分析

摘要

目的： 探讨临床分离的大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及同源性。 方法： 收集2016年1月-2016年3月临床标本中分离的大肠埃希菌共计112株， Vitek2-compact全自动微生物分析仪和常规方法进行细菌鉴定及药敏检测，初步筛选碳青霉烯类耐药大肠埃希菌6株；采用EDTA协同试验和改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型；运用PCR扩增碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaVIM、blaGES、blaIMP、blaNDM、blaGIM、blaOXA-23/48等)、及其他β-内酰胺酶基因（blaTEM、blaSHV、blaCTX-M）及及喹诺酮类药物耐药基因（qnrA、qnrB、qnrS）。对阳性产物进行测序以确定基因型别；通过质粒接合实验检测其耐药基因的转移特性；应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对耐碳青霉烯类大肠埃希菌进行同源性分析；应用多位点序列分析（MLST）确定其等位基因编号及基因序列型（ST型），并利用eBURST软件进行亲缘性分析。 结果: 共检测得6株碳青霉烯类耐药大肠埃希菌，耐药率为5.4%（6/112），其中3株碳青霉烯类耐药大肠埃希菌携带blaNDM，其中1株携带blaNDM-1，1株携带 blaNDM-1和 blaTEM-1，1株菌同时携带 blaNDM-3、blaCTX-M-15及blaTEM-1基因。3株携带 blaNDM基因大肠埃希菌经 EDTA协同实验和改良Hodge实验均为阳性，基因型和表型一致。3株产 blaNDM型大肠埃希菌均通过接合试验将 blaNDM基因传递给了大肠埃希菌 J53感受态菌，成功转移至受体菌，接合子对碳青霉烯类药物均为耐药， PCR扩增接合子并经测序确定blaNDM阳性，并使其获得了相似的耐药特性。另外3株未检测出碳青霉烯酶基因的大肠埃希菌中，1株仅携带blaCTX-M-65基因，1株仅携带blaTEM-1基因，另1株仅携带bla CTX-M-15基因。未检测到bla KPC、bla VIM、bla GES、bla IMP、bla GIM及bla OXA碳青霉烯类耐药基因阴性。6株碳青霉烯类耐药大肠埃希菌均未发现出qnrA、qnrB、qnrS等喹诺酮类药物耐药基因。3株携带blaNDM的大肠埃希菌MLST结果显示为3个不同ST型，分别为ST744、ST167和ST7219，eBURST软件分析示ST744和ST167属于CC10克隆群，ST7912属于CC131克隆群。这3株携带blaNDM的大肠埃希菌经 PFGE成功分型为A、B、C三种不同的克隆型。 结论: 1、本研究所收集本地区耐碳青霉烯类大肠埃希菌均为多重耐（MDR）菌，对替加环素和阿米卡星均敏感，耐药现象严重，其中3株为产blaNDM型的大肠埃希菌，另外3株未检出碳青霉烯类耐药基因。 2、首次在中国发现1株产 blaNDM-3的大肠埃希菌，并且该菌株同时携带blaTEM-1和 blaCTX-M-15基因。另2株产blaNDM型的大肠埃希菌中，1株仅携带blaNDM-1基因，1株同时携带blaNDM-1和blaTEM-1基因。 3、通过MLST和PFGE的方法同时对3株产blaNDM型的大肠埃希菌进行遗传相关性分析发现，3株实验菌无克隆相关性。

目录

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 主要仪器和试剂

2.2 方法

2.2.1 主要试剂的配置

2.2.2 PCR引物的设计与合成

2.2.3 药物敏感性试实验

2.2.4 改良 Hodge 实验

2.2.5 金属 β-内酰胺酶检测（EDTA 协同试验）

2.2.6 耐药基因 PCR 扩增及序列分析

2.2.7 接合实验

2.2.8 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

2.2.9 多位点序列分型(MLST)

第3章 结果

3.1 菌株来源

3.2 药物敏感试验结果

3.3 改良 Hodge 试验结果

3.4 EDTA 协同试验检测金属酶结果

3.5耐药基因的 PCR 检测及测序结果

3.6接合试验结果

3.7脉冲场凝胶电泳（PFGE）结果

3.8 MLST结果

第4章 讨论

第5章 结 论

参考文献

致谢

综述: 大肠埃希菌对β-内酰胺类药物的耐药机制