HIF-2α经Wnt/β-catenin信号通路调节人肺腺癌A549干细胞球Oct-4、Nanog、Sox2的机制研究

摘要

研究背景： 肺癌近年来发病率及死亡率稳步上升，成为了最常见的恶性肿瘤之一。值得注意的是，在肺癌的病理分型中肺腺癌的发病率不断上升并取代了肺鳞癌成为了最常见的病理类型，其5年生存率仅15%，患者的生存期及预后都极不理想。因此，对肺癌的治疗必须从“根源”着手，肿瘤干细胞学说提出肿瘤组织中除了普通肿瘤细胞外，还存在一小部分能够自我更新，不断增殖和分化的肿瘤侧群细胞，是肿瘤复发、转移、化疗耐药等不良预后的“种子”。 在实体肿瘤组织中，肿瘤细胞生存在一个缺氧微环境中，而缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)是肿瘤细胞感知应答其缺氧环境及调节肿瘤干细胞生物学特性的关键因子，在前期的预实验中，我们发现在缺氧诱导条件下A549干细胞球对比常氧状态有更高的HIF-2α及Oct-4表达，因此我们猜想在肺癌干细胞中，HIF-2α可能与 Oct-4等干细胞标记物的表达密切相关。Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤细胞调控传导中的经典通路，在肿瘤细胞的众多恶性行为中都有该通路的激活。我们前期研究发现HIF-2α与β-catenin在缺氧环境中同表达升高，而HIF-2α在肿瘤干细胞中的调控是否与Wnt/β-catenin信号通路的激活相关还不完全清楚，本研究通过过表达HIF-2α及siRNA抑制通路等方法，探讨HIF-2α对A549干细胞球中干细胞生物因子的调控机制。 研究目的： 1、探讨HIF-2α对A549干细胞球中Oct-4、Nanog、Sox2等干细胞标志蛋白的影响。 2、探讨HIF-2α对A549干细胞球Oct-4表达的调控是否与Wnt/β-catenin信号通路的激活相关。 方法： 1、利用无血清培养基（serum-free medium，SFM）方法诱导肺腺癌 A549形成肺腺癌干细胞球。 2、检测常氧条件下A549细胞及A549干细胞球中HIF-2α、β-catenin、Oct-4、Nanog、Sox2 mRNA和蛋白的表达。 3、以HIF-2α过表达病毒及siRNA-βcatenin干扰片段转染A549干细胞球，以RT-PCR及Western Blot法验证细胞过表达及干扰效果。 4、检测经HIF-2α过表达病毒转染前后A549干细胞球中β-catenin、Oct-4、Nanog、Sox2 mRNA和蛋白的表达水平。 5、检测经siRNA-βcatenin转染前后A549干细胞球中Oct-4、Nanog、Sox2 mRNA和蛋白的表达水平。 ６、检测同时转染HIF-2α过表达病毒及siRNA-βcatenin干扰片段与只转染HIF-2α过表达病毒的A549干细胞球中Oct-4 mRNA和蛋白的表达水平。 结果： 1、在常氧条件下，A549干细胞球比A549细胞有更高的HIF-2α、β-catenin、Oct-4、Nanog、Sox2 mRNA及蛋白表达（P＜0.05）。 2、HIF-2α过表达慢病毒转染A549干细胞球后，转染慢病毒组细胞较未处理空白对照组细胞有更高的β-catenin、Oct-4、Nanog、Sox2 mRNA及蛋白表达（P＜0.05） 3、siβ-catenin干扰片段转染A549干细胞球后，转染干扰片段组细胞较未处理空白对照组细胞有更低的Oct-4、Nanog、Sox2 mRNA及蛋白表达（P＜0.05） 4、同时过表达HIF-2α和沉默β-catenin组的A549干细胞球中，Oct-4的表达水平显著低于单纯过表达HIF-2α组（P<0.01），而Nanog、Sox2的表达水平则下降不明显（P＞0.05），两组间比较没有统计学意义。 结论： 1、过表达HIF-2α后，A549干细胞球内Oct-4、Nanog、Sox2干细胞标志蛋白表达显著增高，具有更强的干细胞特性。 2、下调β-catenin后，降低了A549干细胞球内Oct-4、Nanog、Sox2干细胞标志蛋白的表达。 3、在A549干细胞球内，HIF-2α对Oct-4表达的调控可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活相关。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 前 言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验细胞来源

2.1.2 主要试剂及来源

2.1.3主要仪器和设备名称

2.1.4 主要试剂及液体配制

2.2 实验方法

2.2.1 细胞的培养

2.2.2 siRNA的设计合成

2.2.3 siRNA转染A549干细胞球

2.2.4 RT-PCR检测mRNA的表达

2.2.5 Western blot印迹法测各组细胞目的蛋白表达

2.2.6过表达慢病毒构建及转染

2.3 统计方法

第3章 结果

3.1细胞培养的形态观察

3.2 RT-PCR及Western Blot法检测A549细胞及A549干细胞球中HIF-2α、β-catenin及干细胞标志物Oct-4、Nanog、SOX-2的表达

3.3 RT-PCR 及 Western Blot 法检 HIF-2α 过表达慢病毒EPAS1(15237-1)转染前后A549干细胞球β-catenin及Oct-4、Nanog、Sox2的表达

3.4 RT-PCR及Western Blot法检siRNA-β-catenin干扰片段转染前后A549干细胞球中干细胞标志物Oct-4、Nanog、Sox2的表达

3.5 Western Blot法检测HIF-2α过表达病毒转染+siRNA-β-catenin干扰片段转染较过表达A549干细胞球中干细胞标志物Oct-4、Nanog、Sox2的表达

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: Nanog在肿瘤发病及干细胞中的作用及机制