自组装的poly(DEAEMA-co-PhE)纳米颗粒的制备以及运输的CpG药物介导TLR9受体的表达及其免疫活性的作用研究

摘要

研究背景和目的： 核酸不仅能够在生命体储存遗传信息，同时能够在承载体传递遗传信息，而且在复杂的生命过程中起重要调控作用，因此核酸具有非常重要的生物功能。未甲基化的寡聚脱氧核苷酸胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CpG ODN）包含在细菌体内，它能够激活天然免疫系统，从而获得免疫反应。 人工合成的含有CpG ODN的脱氧寡核苷酸具有与细菌的DNA相似的免疫激活作用，当被哺乳动物免疫系统识别时，能够被内吞小体膜上的TLR9受体识别并结合，通过TLR9受体激活下游信号通路，调节Th1/Th2型细胞的免疫应答平衡，维持机体自身的稳定。这些人工合成的寡核苷酸通常具备良好的生物特点：体内低毒性、水溶性好、与靶位点结合的特异性和敏感性高等优点。因此，人工合成的CpG ODN在感染性疾病、变态性反应疾病、过敏性疾病以及癌症的辅助治疗中，可以作为潜在的治疗性DNA和免疫佐剂，从而发挥重要作用。然而，在实际应用中遇到很多问题，一方面，生物在漫长的进化过程中，机体自身发展成的天然防御系统能够抵御各种外来核酸的入侵，使得外源核酸很容易在到达靶点发挥作用前就已被阻挡、清除和降解。例如未经修饰的CpG ODN通常易被细胞内的核酸酶降解，造成细胞摄取率低的局面，使得机体需要重复给药和较高的给药剂量；另一方面，细胞膜主要由带负电荷的脂质双分子层组成，天然核酸分子同样带负电荷，这就使得人工合成的核酸分子难以直接穿过细胞膜进入细胞而难以被机体摄取，这些缺陷都严重地限制CpG ODN在生物医学方向上的应用和推广。近年来，生物纳米材料的出现为核酸药物的递送问题提供了新的研究方法。大量研究报道显示，由纳米材料负载的CpG核酸药物在实际应用中表现出优良的性能，比如高活性、低毒性、良好生物相容性等特点，同时，药物在纳米材料的保护下，可延长在体内的半衰期和作用时间。因此，由CpG核酸药物与纳米材料的结合，有望作为新型免疫治疗制剂的研究方向，应用于相关疾病的预防和治疗中。本研究的主要目的旨在观察纳米材料poly(DEAEMA-co-PhE）作为载体运载的CpG ODN1826能否增加TLR9受体的表达以及促进炎性因子IL-6、TNF-α的分泌。 方法： 1.纳米材料poly(DEAEMA-co-PhE）作为载体的制备：采用的是将单体通过可逆加成-断链转移聚合（RAFT）的方法得到，继而对制备的纯净的纳米材料进行表征，利用核磁共振氢谱（1H-NMR），傅里叶红外光谱和透射电镜（TEM）以及Zeta电势验证所制备的纳米材料的在生物方面的特点。通过MTT法测定poly(DEAEMA-co-PhE）最佳的生物相容性，采用紫外分光光度计（UV）测定载药量以及体外药物释放率。 2.poly(DEAEMA-co-PhE）作为载体运载的CpG ODN1826药物诱发免疫调节的影响：为了测试poly(DEAEMA-co-PhE）载 CpG ODN1826的影响，将RAW264.7细胞作为实验的目的细胞，建立四个组：第一组，正常组（Control）；第二组，自由CpG ODN1826药物处理RAW264.7细胞组（CpG组）；第三组，poly(DEAEMA-co-PhE）处理的 CpG ODN1826药物组（CpG+DM）；第四组poly(DEAEMA-co-PhE）处理的RAW264.7细胞组（DM）。而由于TLR9受体蛋白为胞内蛋白，而且分泌量极少，因此通过检测核因子NF-κB的表达来测定TLR9受体的表达量。CpG ODN1826对 TLR9受体表达的影响可用蛋白印迹（Western Blot）检测，对炎性因子TNF-α、IL-6分泌的影响可用酶联免疫吸附测定（enzume linked immunosorbent assay,Elisa）检测。通过Confocal荧光成像观察poly(DEAEMA-co-PhE）在细胞内的分布情况。 结果： 合成的poly(DEAEMA-co-PhE）大小均一，形状为圆滑的球状颗粒形状。而用CCK-8法检测其毒性发现，纳米颗粒对细胞具有很低的毒性，当药物浓度高达700μg/mL时，细胞成活率才低90%，这说明由poly(DEAEMA-co-PhE）纳米材料作为载体，具有良好的生物相容性；与CpG ODN1826药物结合后，得到复合物poly(DEAEMA-co-PhE）-CpG在水中的分散性良好，载药量大约为10%。体外释放结果显示CpG ODN可以缓慢的从poly(DEAEMA-co-PhE）载体中释放，120h后累计释放率为67.1%。poly(DEAEMA-co-PhE）处理CpG ODN1826对核因子 NF-κB影响的蛋白印记结果为：CpG组以及复合物poly(DEAEMA-co-PhE）-CpG处理的CpG ODN1826药物组（CpG+DM）分别与Control组对比，NF-κB核因子表达均明显上调（P＜0.01）；而DM组与Control组相比，NF-κB核因子表达基本无明显变化（P＞0.05）；CpG组与poly(DEAEMA-co-PhE）处理的CpG ODN药物组（CpG+DM）相比较，NF-κB核因子的表达明显降低（P＜0.01）。而 Elisa结果表明，Control组与 CpG组以及poly(DEAEMA-co-PhE）处理的CpG ODN药物组（CpG+DM）分别相比较，IL-6以及TNF-α的分泌量明显增加（P＜0.01），而DM组与Control组相比较，IL-6以及TNF-α并无明显变化（P＞0.05），这与蛋白印记结果一致。而Confocal荧光成像结果表明，poly(DEAEMA-co-PhE）主要分布在胞浆内，并未进入到细胞核，这从另一方面说明了载体的保护作用，同时，由于载体自身所带的荧光特性，不仅仅可以作为生物载体，还可以作为生物探针，大大将生物学的领域扩展开来，为生物医学的发展提供新的研究方向。 结论： 制备的poly(DEAEMA-co-PhE）在水中具有良好的分散性，能够缓慢的释放CpG药物，同时具有低毒性，尺寸小等优点。而由纳米颗粒poly(DEAEMA-co-PhE）运载的CpG ODN1826药物能够明显的诱导TLR9受体表达上调，并伴有炎性因子IL-6以及TNF-α分泌量明显增加，从而提高机体的免疫活性。

目录

声明

中英缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 统计学方法

第3章 结果

3.1 poly(DEAEMA-co-PhE）核磁共振氢谱和傅里叶红外光谱结果

3.2 poly(DEAEMA-co-PhE) Zeta电势测定

3.3 poly(DEAEMA-co-PhE)载体形态和粒径测定结果

3.4 CCK-8法检测poly(DEAEMA-co-PhE）的生物毒性

3.5 poly(DEAEMA-co-PhE）载药量的测定

3.6 poly(DEAEMA-co-PhE）控释效应

3.7 poly(DEAEMA-co-PhE）-CpG对TLR9受体表达的上调

3.8 poly(DEAEMA-co-PhE）-CpG对TNF-α、IL-6分泌的影响

3.9 激光共聚焦荧光显微镜(Confocal)成像

第4章 讨论

第5章 结论

第6章 不足和展望

致谢

参考文献

攻读学位期间研究成果

综述: CpG ODN的免疫学特性及其作用研究