丰富环境改善重金属混合暴露所致的大鼠认知损伤及其相关分子机制

摘要

研究目的： 环境重金属污染已成为严重影响人群健康的公共卫生问题，其中铅（Lead, Pb）、镉（Cadmium,Cd）和汞（Mercury, Hg）暴露所造成的健康危害较为严重，这些重金属通常共存于人类生活环境中，早期接触可致儿童认知功能发育不良。已有研究发现丰富环境干预可提高认知能力，那么丰富环境干预是否对重金属混合暴露所致的认知损伤有所改善？可能的分子机制又如何？本研究通过饮用水暴露Pb、Cd和Hg三种重金属混合物，分别建立生命早期（胚胎至断乳前）和持续（胚胎至成年）重金属混合染毒以及丰富环境干预Sprague Dawley(SD)大鼠模型，探索丰富环境干预对Pb、Cd和Hg三种重金属混合暴露所致大鼠认知损伤的改善作用及其可能的机制，为进一步深入研究重金属污染物的神经毒性损伤改善提供科学依据。 研究方法: 1.动物模型建立： 9周龄性成熟无特定病原体级（Specific pathogen free, SPF）大鼠，按雄鼠：雌鼠=1:2的比例合笼配对，将受孕成功的雌性大鼠随机分至对照组（仅饮用去离子水）、持续暴露组（仔鼠在胚胎和断乳前通过母鼠饮用含有250mg/L的三水乙酸铅、75mg/L的氯化镉和1.5mg/L的氯化汞混合液染毒，在断乳后饮用含有83.333mg/L的三水乙酸铅、10mg/L的氯化镉和0.5mg/L的氯化汞混合染毒液直至成年）、断乳前暴露组（仔鼠在胚胎和断乳前通过母鼠饮用含有250mg/L的三水乙酸铅、75mg/L的氯化镉和1.5mg/L的氯化汞混合液染毒，在断乳后仅饮用去离子水）和丰富环境干预组（仔鼠在胚胎和断乳前通过母鼠饮用与断乳前暴露组相同浓度的Pb、Cd、Hg混合液染毒，在断乳后则饮用去离子水，并从出生后第1天开始给予丰富环境干预刺激，直至成年）。 2.全血和脑组织中重金属含量测定： 采用微波消解对全血及大脑组织进行消解。通过电感耦合等离子体质谱仪（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）检测大鼠全血及脑组织中Pb和Cd的含量，冷蒸汽原子荧光光谱法（cold vapor atomic fluorescence spectrometry, CV-AFS）检测全血及脑组织中Hg的含量。 3.神经行为学检测： 通过 Morris水迷宫试验检测大鼠的空间学习记忆能力；通过八臂迷宫试验检测大鼠的工作记忆能力。 4.树突棘、神经突触结构检测： 通过Golgi-Cox染色观察大鼠海马CA1、CA3和DG区以及前额叶皮层（PFC区）的树突棘密度及类型变化；用透射电镜观察海马CA1区神经突触超微结构改变。 5.Snk、SPAR mRNA及蛋白表达检测： 通过逆转录PCR（Reverse transcription PCR,RT-PCR）检测大鼠海马血清诱导激酶（Serum-inducible kinase, Snk）以及树突棘相关Rap-特异性GTPase-活化蛋白（Spine-associated Rap guanosinetriphosphatase activating protein, SPAR）的mRNA表达改变；通过免疫荧光和激光共聚焦技术以及蛋白免疫印迹技术（Western Blot）检测大鼠海马Snk、SPAR蛋白表达改变。 6.海马神经元损伤情况： 应用透射电子显微镜观察大鼠海马神经元细胞核及细胞器的损伤，同时通过流式细胞术测定大鼠海马神经元细胞内活性氧水平和细胞凋亡水平以分析大鼠海马神经元的损伤情况。 研究结果： 1.丰富环境对Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠全血及脑组织中重金属含量影响。ICP-MS和CV-AFS的检测结果发现，持续Pb、Cd、Hg混合暴露的大鼠全血及脑组织中三种重金属含量均高于对照组（P＜0.05），而丰富环境组和断乳前暴露组大鼠全血及脑中除Pb均未检出外，Cd和Hg的含量均低于持续暴露组（P＜0.05），且都高于对照组（P＜0.05）。 2.丰富环境对Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠认知行为的影响。 Morris水迷宫和八臂迷宫试验发现，丰富环境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所致大鼠空间学习记忆以及工作记忆损伤：在 Morris水迷宫测试中发现，持续暴露组和断乳前暴露组大鼠寻找平台的逃避潜伏期明显高于对照组（P＜0.05），而丰富环境干预组大鼠的逃避潜伏期明显低于断乳前暴露组（P＜0.01），而与对照组逃避潜伏期相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）。在八臂迷宫测试中，持续暴露组和断乳前暴露组大鼠寻找食物的潜伏期明显高于对照组（P＜0.01），而丰富环境干预组大鼠的潜伏期明显低于断乳后自然恢复的断乳前暴露组（P＜0.01），与对照组潜伏期相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）。 3.丰富环境对Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠树突棘形态结构的影响。通过Golgi-Cox染色发现，丰富环境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所致大鼠脑组织树突棘密度减少。持续暴露组和断乳前暴露组的大鼠海马各区域的树突棘密度均低于对照组（P＜0.01），且持续暴露组的大鼠海马CA1、DG区和PFC区树突棘密度低于断乳前暴露组（P＜0.01），而丰富环境干预组和断乳前暴露组（断乳后自然恢复）的大鼠海马 CA1、CA3、DG区以及皮层 PFC区树突棘密度相对于持续暴露组有所增加，但尚未增加到对照组水平（断乳前暴露组分别增加到对照组的91.38%、85.33%、84.46%和81.31%，丰富环境干预组分别增加到对照组的93.85%、89.16%、81.72%和94.32%），而且丰富环境干预组CA1、CA3和 PFC区的树突棘密度相比于未进行干预的断乳前暴露组分别增加了约2.71%、4.49%和16.01%。 此外，丰富环境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所影响的大鼠树突棘类型，但并没有恢复至对照组水平。持续暴露组和断乳前暴露组的海马 CA1、CA3区和皮层 PFC区的蘑菇型树突棘比例低于对照组（P＜0.05）；而丰富环境干预组和断乳前暴露组（断乳后自然恢复）的海马各区蘑菇型树突棘比例较持续暴露组均有所增加；此外，丰富环境干预组海马CA1区蘑菇型树突棘比例高于断乳前暴露组（P＜0.05）、PFC区蘑菇型树突棘比例高于持续暴露组（P＜0.01）。 4.丰富环境对Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠海马CA1区神经元突触超微结构的影响。 通过透射电子显微镜观察发现，丰富环境改善了Pb、Cd、Hg混合暴露所致的突触形态结构的损伤：具体表现在与对照组相比，持续暴露组和断乳前暴露组大鼠海马CA1区突触密度降低、PSD厚度变薄、突触间隙变宽和突触活性带长度变短（P＜0.01）；而相比于断乳后自然恢复的断乳前暴露组，丰富环境的干预使大鼠海马CA1区突触密度和PSD厚度增加（P＜0.05），断乳前暴露的大鼠和丰富环境干预的大鼠相比于持续暴露的大鼠突触间隙变窄（P＜0.01），但是丰富环境的干预能使突触活性带长度改善，但尚不能恢复对照组水平（P＜0.05）。 5.丰富环境对Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠海马Snk、SPAR mRNA和蛋白表达影响。 通过RT-PCR和Western Blot检测发现，丰富环境降低了Pb、Cd、Hg混合暴露所致Snk的mRNA和蛋白表达的升高。持续暴露组大鼠海马Snk mRNA和蛋白表达高于对照组（P＜0.05），而断乳前暴露组和丰富环境干预组大鼠海马Snk的 mRNA和蛋白表达均低于持续暴露组（P＜0.05），丰富环境干预组大鼠海马Snk的mRNA和蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；各处理组大鼠海马SPAR的mRNA表达差异没有统计学意义（P＞0.05）。而免疫荧光检测发现丰富环境上调了Pb、Cd、Hg混合暴露所致大鼠海马SPAR表达水平的下降。与对照组相比，持续的Pb、Cd、Hg的混合暴露以及断乳前Pb、Cd、Hg混合暴露导致大鼠海马的SPAR的表达降低（P＜0.01），而相比于自然恢复的断乳前暴露组，丰富环境的干预使海马CA1区SPAR的表达增加（P＜0.05），但尚未增加到对照组水平（P>0.05）。 6.丰富环境对Pb、Cd、Hg混合暴露大鼠海马神经元损伤的影响。 透射电子显微镜观察发现，丰富环境干预能改善Pb、Cd、Hg混合暴露所致海马神经元损伤。通过电镜检测发现，持续暴露组和断乳前暴露组大鼠海马神经元核内染色质聚集成团边集，核膜尚完整，细胞器数目也出现减少，线粒体有较严重的肿胀，嵴断裂而模糊不清，而丰富环境干预组大鼠与对照组则相似，其海马神经元核膜光滑，染色质分布较均匀，细胞器数目增加，线粒体及其嵴形态也较完整清晰。 通过流式细胞术分析发现，与对照组相比，持续暴露组和断乳前暴露组大鼠海马神经元细胞内活性氧水平和细胞凋亡水平均显著增高（P＜0.01）；与自然恢复的断乳前暴露组大鼠相比，丰富环境干预组大鼠的海马神经元细胞内活性氧水平降低了16.75%、细胞凋亡水平降低了32.28%（P＜0.01）。 研究结论： 1. Pb、Cd和Hg的混合暴露能造成大鼠的认知损伤，而且生命早期此三种重金属混合暴露，断乳后脱离暴露至成年后，大鼠认知损伤很难自然恢复； 2.丰富环境能改善Pb、Cd和Hg混合暴露所致大鼠的认知损伤，可能与大鼠突触结构可塑性和树突棘支架蛋白SPAR表达有关；也可能与丰富环境降低了海马神经元细胞内氧化应激水平及神经元损伤有关。 3.丰富环境改善Pb、Cd和Hg混合暴露所致大鼠的认知损伤，为进一步深入研究重金属污染物的神经毒性损伤改善提供科学依据。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 试验方法

第3章 结果

3.1 丰富环境对Pb、Cd和Hg混合暴露大鼠发育情况的影响

3.2 成年大鼠全血以及脑组织中Pb、Cd和Hg重金属含量

3.3 丰富环境对Pb、Cd和Hg混合暴露大鼠认知功能的影响

3.4 丰富环境对Pb、Cd和Hg混合暴露大鼠突触结构可塑性的影响

3.5 丰富环境对Pb、Cd和Hg混合暴露大鼠海马Snk、SPAR蛋白及mRNA表达的影响

3.6 丰富环境对Pb、Cd和Hg混合暴露大鼠海马神经元损伤的影响

第4章 讨论

第5章 结论与创新

5.1 主要结论

5.2 本课题的创新之处

第6章 不足与展望

6.1 本课题的不足之处

6.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:丰富环境对中枢神经系统突触可塑性的影响