结核病患者血浆差异表达环状RNA的筛选及其在结核病诊断中的应用研究

摘要

研究背景： 结核病(TB)是由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起的一种慢性免疫紊乱性疾病，由于缺乏理想的诊疗相关标志物，结核病的防控面临严峻的挑战，这也是导致在全球范围内结核病愈演愈烈的主要原因之一。环状RNA（circular RNA， circRNA）是新近发现的一种内源性RNA，其进化保守，具有组织和发育阶段特异性，在细胞质中丰富而稳定地存在。越来越多的研究提示 circRNA参与了多种人体的病理、生理过程，可以作为肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等疾病潜在的诊疗标志物。circRNA在机体抗 Mtb感染过程中的作用以及能否作为结核病诊疗标志物目前尚鲜见报道。 研究目的： 通过基因芯片技术检测肺结核患者血浆中 circRNA的表达谱，筛选并鉴定具有成为结核病诊断标志物潜力的circRNA；探讨筛选的circRNA与结核病病情严重程度的相关性及其在抗结核治疗效果评估方面的能力，以期为结核病的诊疗提供新的标志物。 研究方法： 采用基因芯片技术分别检测3例活动性肺结核患者和3例健康对照者血浆中 circRNA的表达谱，挑选6条上调表达中差异最显著的 circRNA（hsa_circ_0009024, hsa_circ_0001953, hsa_circ_0008297, hsa_circ_0003528, hsa_circ_0003524和hsa_circ_0015879）在50例活动性肺结核患者和50例健康对照者血浆中进行实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）验证。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析circRNA对肺结核的诊断价值。采用Spearman分析circRNA的表达水平与结核病患者疾病严重程度的相关性。收集120例活动性肺结核患者、100例健康体检者、40例肺炎患者、40例COPD患者、40例肺癌患者的外周血，分离血浆样本，采用 qRT-PCR检测各组血浆中 hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024的表达，应用 ROC曲线分析 hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024诊断肺结核的敏感度和特异度。对25例接受规范抗结核治疗的肺结核患者治疗前及治疗后第6个月血浆中 hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024表达水平进行动态监测。 研究结果： 1．基因芯片检测结果显示，肺结核患者血浆中有61条 circRNA存在差异性表达，其中上调43条，下调18条。qRT-PCR验证结果显示，与健康对照组相比，肺结核患者血浆中hsa_circ_0009024、hsa_circ_0001953、hsa_circ_0008297、hsa_circ_0003528、hsa_circ_0003524、hsa_circ_0015879表达均显著上调，与芯片检测结果一致。 2. ROC曲线分析结果显示，hsa_circ_0001953、hsa_circ_0009024、hsa_circ_0003528、hsa_circ_0003524，hsa_circ_0008297和 hsa_circ_0015879诊断肺结核的曲线下面积（AUC）分别为0.856、0.808、0.768、0.715、0.692和0.676。相关性分析结果显示，hsa_circ_0001953（P<0.001）、hsa_circ_0009024（ P=0.001）、hsa_circ_0008297（ P=0.027）与患者疾病严重程度相关，而hsa_circ_0015879（P=0.135）、hsa_circ_0003528（P=0.336）和hsa_circ_0003524（P=0.578）与疾病严重程度无关性。 3.扩大样本量检测可知，肺结核患者血浆 hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024表达显著高于健康对照组和疾病对照组（肺炎、COPD、肺癌患者），差异有统计学意义（ P<0.001）。ROC曲线分析结果显示，血浆hsa_circ_0001953鉴别肺结核与健康人群的AUC为0.826，敏感度和特异度分别为69.17%和89.00%；血浆hsa_circ_0009024鉴别肺结核与健康人群的AUC为0.777，敏感度和特异度分别为60.00%和86.00%；联合 hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024鉴别肺结核与健康人群的AUC为0.915，敏感度为72.5%，特异度为96.00%。联合 hsa_circ_0001953和 hsa_circ_0009024鉴别肺结核与疾病对照组患者的AUC为0.897，敏感度为79.17%,特异度为86.67%。与抗结核治疗前相比，肺结核患者接受规范抗结核治疗6月后血浆 hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024表达水平显著下降。 结论： 1.与健康志愿者相比，肺结核患者血浆中circRNA表达谱发生部分变化，提示circRNA可能在肺结核病发生发展中发挥作用。 2.Hsa_circ_0001953和 hsa_circ_0009024在肺结核患者血浆中表达显著升高，且与疾病严重程度正相关，在有效抗结核治疗后二者表达水平显著下降，有望成为肺结核诊断及疗效监测的潜在生物标志物。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 研究对象

2.4 外周血血浆分离与保存

2.5 血浆总RNA的提取

2.6 血浆总 RNA质量检测

2.7 标记反应

2.8 标记/扩增RNA的纯化

2.9 杂交

2.10 芯片洗涤

2.11 qRT-PCR检测

2.12 统计学分析

第3章 结果

3.1 样本总RNA的质量检测

3.2 肺结核患者和健康对照者血浆中circRNA表达谱分析

3.3 qRT-PCR验证芯片结果

3.4 ROC曲线评估血浆差异表达circRNA对肺结核的诊断效能

3.5 血浆差异表达 circRNA 与肺结核患者疾病严重程度的相关性分析

3.6 验证血浆hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024对结核病的诊断效能

3.7 不同类肺部疾病血浆中hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024表达水平分析比较

3.8 肺结核患者有效抗结核治疗前后血浆中hsa_circRNA_001953和hsa_circRNA_0009024表达变化

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:环状RNA作为疾病标志物的研究进展