HBHA蛋白在结核病诊断中应用研究

摘要

目的：制备天然肝素结合血凝素(HBHA)蛋白，构建重组质粒原核表达纯化HBHA蛋白，并比较天然蛋白和重组蛋白的聚集BCG活性。探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。rn 方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PE80L克隆表达载体中，构建PQE80L-HBHA重组质粒，经BamH Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切2小时，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后进行测序。将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌(E.coli) BL-21株，重组菌经0.3mmol·L-lIPTG诱导5小时。将IPTG诱导后400ml菌液lOOOOrpm离心5min收菌，弃上清，用bindingbuffer重悬，冰浴条件下超声5次，每次10秒，分别收集裂解沉淀和上清，加2×上样缓冲液混匀，煮沸lOmin，120009离心5min，上清进行SDS-PAGE。重组蛋白多出现在破碎后的上清中，表明以可溶性形式存在。将超声裂解后的上清通过已用Binding buffer平衡的Ni-琼脂糖柱上，再用lOml的Binding buffer冲洗柱子，最后用3ml的Elution buffer将蛋白洗脱并收集蛋白。并以此rHBHA免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时，将7H9液体培养基中的卡介苗(BCG)培养至稳定生长期，离心收集BCG菌体，用PBS重悬菌体加入Triton X-100，冰浴条件下超声IO次，每次30秒，在-70℃和37℃反复冻融数次。然后，继续超声10次。13000g离心30分钟，留取上清，将上清通过已用PBS平衡的HeparinSepharose CL-6B，再用lOOmL PBS冲洗柱子，用不同NaCI盐离子浓度梯度的PBS将nHBHA洗脱，收集各浓度梯度洗脱蛋白。取少量样品进行SDS-PAGF电泳，并用Western blot鉴定天然HBHA蛋白(nHBHA)，证实得到nHBHA蛋白。然后用不同浓度的(O，0.2，0.5，2.O，5. 0) ug·mL-lrHBHA和nHBHA分别加入到培养BCG的7H9液体培养基中，36小时后观察其诱导BCG聚集情况。同时，将HBHA蛋白与抗HBHA抗体以最适比例37℃孵育一小时后，再将孵育过的蛋白加入到BCG培养基中，36小时观察抗体对不同浓度nHBHA和rHBHA诱导BCG聚集效应的影响。rn 结果:结核分枝杆菌HBHA基因成功地克隆到PQE80L克隆表达载体中，并在E.coliBL-21中获得了高效表达，SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析法纯化获得的蛋白纯度大于92%。天然HBHA蛋白提取在梯度洗脱时，含有342mmoI·L-lNaCl的PBS洗脱获得纯度较高的nHBHA。所得天然和重组蛋白均有诱导BCG聚集的作用，并且天然HBHA诱导聚集能力强于重组HBHA蛋白，此种凝集均可被抗HBHA多克隆抗体抑制。rn 结论:成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白；证实了两者均具有促进BCG聚集的功能，并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。该抗体能结合nHBHA的实验结果提示，该抗体及rHBHA在检测血液中相应的HBHA抗原和抗体中具有潜在临床诊断价值，从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。