构建转基因细胞检测亲电性化学污染物的研究

摘要

亲电性化学物是指在环境污染物中一大类可与细胞生物大分子上的亲核中心相结合或可通过生物转化相结合的化合物，除可以引起急、慢性中毒外，还可引起肿瘤。亲电性化学物是环境中的主要污染物，所以越来越引起环境科学研究者的高度关注。 环境污染物多数为亲电性(Electrophile)化学物质，如TCDD,CdCl2,多氯联苯，HgCl2,Pb(C2H3O2)2等。国外许多学者研究发现[1-6]，在哺乳动物细胞中，具有与亲电性化学物发生反应的特异DNA基序(Motif)，称为亲电性物质反应元件(ElectrophileResponseElement，EPRE)，这一基因的调控区基序是非常保守的，调控下游有关基因的表达。EPRE可介导多种与机体抗氧化有关的基因的表达，如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因，半胱氨酸谷胱甘肽转移酶基因等，其酶活性的表达程度与亲电性化学污染物对EPRE激活程度有关，两者间存在剂量反应关系。 本研究根据细胞双杂交原理，分别从p(Gal4)5-TK/CAT和pMT/V5-His扩增TK(胸腺嘧啶)和MT(金属硫蛋白)基因基本启动子，分别与虫荧光素酶报告基因(LUC)相连，将人工合成的亲电性化学反应元件(EPRE)插入LUC的上游，构建成亲电性化学物调控的LUC报告载体(pEPRE-TK-LUC和pEPRE-MT-LUC)。用脂质体将pERRE-TK-LUC和pEPRE-MT-LUC分别转染于HeLa细胞和昆虫细胞(Sf9)。用瞬时表达法发现重组HeLa细胞荧光素酶与亲电性化学物氯化汞、氯化镉和亚砷酸钠具有剂量效应关系，而重组Sf9与亲电性化学物无剂量效应关系，这可能是Sf9对亲电性化学物质的毒性特别敏感。用G418对重组HeLa细胞进行筛选，阳性细胞经顺丁烯乙酸二乙酯(DEM)实验，发现荧光素酶与DEM间存在剂量效应关系。然而，在正常的pH条件下，底物D-荧光素不能进入细胞，在测定荧光素酶的表达量时，必须通过裂解细胞。由于荧光素酶的催化效率极高，故发出的光非常短暂(＜10秒)，这为高通量监测亲电性化学物的污染程度的实际应用造成了困难。建议进一步研究可持续发光的细胞监测亲电性化学污染物。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

文献综述

参考文献

第一部分合适启动子的选择和克隆

第二部分亲电性化学物调控的荧光素酶报告基因载体的构建及其在细胞中的表达

第三部分瞬时表达法对亲电性化合物的实验研究

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文