抗马立克氏病病毒VP22蛋白单克隆抗体的研制及应用

摘要

1马立克氏病CVI988病毒VP22基因克隆与原核表达 以感染CVI988/Rispens疫苗株的鸡胚成纤维细胞的DNA为模板，根据Genbank上公布的基因序列设计不同引物，用PCR扩增VP22全基因及不同片段，分别命名为VP22、VP22T、VP22C、VP22H，并将各个基因片段，克隆入pGEX-6P-1中，转化BL21感受态细胞。阳性菌经测序正确后，按1：100比例接种2mLLB液体培养基，过夜培养，再以1：100比例接种10mL2×YT液体培养基，37℃200rpm摇3h后，加0.5mMIPTG；诱导5h后，终止培养，进行SDS-PAGE。结果发现，只有VP22羧基端能够得到高效可溶性表达，命名为VP22C-GST。同时，对表达条件进行优化，发现在不同IPTG工作浓度的诱导下，表达产物均呈高效可溶性表达。将表达产物免疫小鼠获得的多抗进行IFA和Western-blot实验结果表明GST-VP22C有免疫原性，为VP22单抗制备和功能研究奠定了基础。 2抗马立克氏病病毒VP22蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性 VP22C与GST融合表达产物GST-VP22C经SDS-PAGE，切取特异性条带作为免疫原，经腹腔免疫注射6周龄雄性Balb/c小鼠，0.3mL/只，10天一免。加强免疫3d后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用RB1B病毒感染CEF进行间接免疫荧光试验(IFA)反复筛选阳性克隆，并经有限稀释法3次亚克隆，结果获得了5株特异性分泌抗马立克氏病病毒VP22蛋白的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为MDVVP22C-3F7、MDVVP22C-4E4、MDVVP22C-4E12、MDVVP22C-4A10、MDVVP22C-2E1。这5株单抗能与所有试验的MDV-1病毒发生特异性反应，而不与其它常见禽病毒如新城疫病毒(NDV)、禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)、禽腺病毒(Fowladenovirus)、传染性法氏囊病毒(IBDV)反应。5株单抗的腹水IFA效价在1：6000-16000之间。其中单抗3F7、4E12具有ELISA和Western-blot反应性，且能与杆状病毒表达的VP22反应，而4E4、4A10、2E1无Western-blot效价，不可与杆状病毒表达的VP22反应，但能与COS-1暂态表达的VP22反应。单抗在液氮中冻存半年后复苏出来仍能稳定地分泌抗VP22特异性抗体。这些单抗的研制为VP22蛋白功能的相关研究奠定了坚实基础。 3利用单克隆抗体研究VP22蛋白的细胞转导功能 通过IFA，利用制备的VP22特异性多抗和单克隆抗体4E4对CVI988病毒不同时间段感染的CEF，转染VP22的COS-1细胞，VP22在细胞间的扩散试验进行检测。结果发现：除MDV感染CEF的空斑和转染COS-1细胞的核亮染外，空斑周围正常细胞核、转染细胞周围的细胞核均有高度聚集VP22。这表明VP22可以高效转导入所有细胞核中。而利用真核表达的蛋白观察VP22在细胞间的扩散试验中发现，VP22可以摄入不同种类的所有细胞中，且定位于核内。表明基因工程方法表达的VP22蛋白具有高效的细胞间转导功能。这为进一步利用VP22携带其他蛋白进行转导奠定了良好的基础。

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