应用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻新品系

摘要

水稻条纹病毒(Ricestripevirus)是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表成员，该病毒造成的水稻条纹叶枯病是当前我国水稻上一种分布广，发生重，为害大的重要病毒病。本文通过转基因技术，分别将CP与SP基因反向重复序列整合入水稻基因组，以便得到抗病品种。 取本研究室试验田中感病水稻品种苏御糯中发病症状明显的水稻叶片，用以提取水稻条纹病毒RNA，通过RT-PCR扩增获得CP、SP基因片段。得到的CP、SP基因片段经BglⅡ和XhoⅠ双酶切并且回收相应片段，再将其连接到同样双酶切的中间载体pUCCRNAi上，得到重组质粒pUCCRNAi-CP-1、pUCCRNAi-SP-1。对重组质粒中的CP、SP目的片段进行测序并将测序结果与NCBI数据库上公布的相应病毒基因序列进行BLAST，两片段与同源性最近的分离群分别有5和2个碱基差异。将重组质粒pUCCRNAi-CP-1、pUCCRNAi-SP-1经BamHI和SalⅠ双酶切并且回收相应片段，与CP、SP基因片段经BglⅡ和XhoⅠ双酶切回收的相应片段连接，进一步得到RNA干扰载体重组质粒pUCCRNAi-CP-2、pUCCRNAi-SP-2。再利用PstⅠ酶切已构建成功的RNA干扰载体重组质粒，并回收相应的目的片段，将其连接到同样双酶切的植物表达载体pCam23A，分别得到植物表达载体pCam23A-CP、pCam23A-SP。并通过DNA直接转化法将植物表达载体pCam23A-CP、pCam23A-SP分别转化入农杆菌，再通过农杆菌介导法将CP与SP基因反向重复序列分别转化入广陵香粳与苏御糯水稻品种中，经过筛选，分化，获得转基因水稻植株。 PCR分析结果显示CP与SP基因已经整合到水稻基因组中，对每株转基因苗进行了接虫传毒试验，同时还接种了只转入抗性标记基因的粳稻品种广陵香粳与苏御糯为对照，抗性鉴定结果显示，四个转基因品系植株都获得了干扰抑制外源病毒单个基因表达的能力，从而在对水稻条纹叶枯病的抗病性上得到了显著的提升。利用RT-PCR手段检测接种传毒的转反向重复结构的CP蛋白(SP蛋白)基因植株与对照植株，结果表明转基因植株中接种10天后都没有检测到病毒SP蛋白(CP蛋白)基因的存在，而对照植株在接种10天后都检测到病毒RNA。这也表明了病毒的复制在转基因植株中受到了明显的抑制，转基因植株获得了干扰抑制外源病毒基因表达的能力。同时验证了外壳蛋白(CP)和病害特异性蛋白(SP)基因在寄主体内的复制及产生病症具有紧密的关系、两者单独作用都不能致病的观点。

目录

论文说明：图表目录

摘要

缩略语中英文对照

1.前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

参考文献

附录

致谢