OBF-1对MRL-lpr小鼠抗体分泌细胞产生及自身免疫发展的功能研究

摘要

OBF-1(Oct binding factor-1)又称OCA-B或Bob-1，是B细胞特异性转录共激活因子。已发现OBF-1能调节B细胞发育和功能，在OBF-1缺陷小鼠中，B细胞成熟的多个阶段受到影响，完全破坏生发中心的形成，导致体液免疫缺陷。MRL/MpJ-Fas<'lpr/lpr>(MRL-lpr)小鼠以产生自身抗体和免疫复合物介导的肾小球肾炎为特征，是研究系统性红斑狼疮的主要模型之一。本研究构建了OBF-1 缺陷MRL-lpr小鼠和OBF-1野生MRL-lpr小鼠，并在这两种模型小鼠的基础上，研究OBF-1缺陷对抗体分泌细胞产生及自身免疫发展的影响。 1 OBF-1缺陷MRL-lpr小鼠及OBF-1野生MRL-lpr小鼠模型的建立将MRL-lpr小鼠与OBF-1缺陷小鼠进行杂交，产生子一代小鼠(F1)，再将F1小鼠雌雄配对产生子二代小鼠(F2)，用PCR对F2小鼠进行基因型鉴定(OBF-1和Fas基因)，从中挑选出OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠，再与亲代小鼠MRL-lpr回交。经如此杂交-回交6～8代，获得OBF-1缺陷MRL-lpr小鼠(OBF-1<'-/->Fas<'-/->)及OBF-1野生MRL-lpr小鼠(OBF-1<'+/+>Fas<'-/->)。 2 OBF-1缺陷对MRL-lpr小鼠抗体分泌细胞产生和自身免疫发展的影响2．1 OBF-1缺陷对MRL-lpr小鼠自身免疫发展的影响选用3-4月龄基因型为OBF-1<'+/+>Fas<'-/->和OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠各6只，利用夹心ELISA法检测每只小鼠血清中所有免疫球蛋白、抗双链DNA抗体(ds-DNA抗体)和抗核抗体(ANA)，结果表明OBF-4<'+/+>Fas<'-/->小鼠血清中的所有的免疫球蛋白显著增高，尤其是IgG亚类(IgG1、Ig2a、IgG3、IgG2b)，其中IgG2a含量最低有5000μg/mL，而OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠血清IgG各亚类含量均降低，其中IgG2a含量最高仅为200μg/mL。OBF-1<'+/+>Fasb<'-/->小鼠血清中能检测出自身抗体(抗ds-DNA抗体及抗核抗体)，而在OBF--<'-/->Fas<'-/->小鼠不能检测到，以上结果显示表明MRLlpr小鼠OBF-1缺陷可使所有免疫球蛋白水平显著降低，消除自身抗体。免疫荧光染色发现OBF-1<'+/+>Fas<'-/->小鼠肾小球有IgG和补体C3沉积，而OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠肾脏没有沉积；PAS法染色发现OBF-1<'+/+>Fas<'-/->小鼠肾小囊腔增大，并形成新月体，而OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠。肾脏没有上述现象。结果说明OBF-1缺陷能抑制MRL-lpr小鼠免疫复合物介导的血管球性肾炎的发生。 2．2 OBF-1缺陷对MRL-lpr小鼠自身抗体产生缺陷的机制通过ELISPOT检测OBF-1缺陷对MRL-lpr小鼠抗体分泌细胞的影响，OBF-1<'+/+>Fas<'-/->小鼠脾脏检测到大量IgG抗体分泌细胞(约820个斑点/10<'5>脾细胞)，而OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠脾脏只检测到少量IgG抗体分泌细胞(约5个斑点/10<'5>脾细胞)，骨髓中检测结果与脾脏类似，结果显示OBF-1对MRL-lpr小鼠抗体分泌细胞的产生是必需的。 通过半定量RT-PCR法检测对浆细胞特异性基因Blimp-1，Xbp-1，Irf-4，Bcl-6和J链的表达，结果表明OBF-1<'+/+>Fas<'-/->小鼠相比，OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠Irf-4、xbp-1、Blimp-1、Bcl-6 mRNA水平没有明显差别，而J链mRNA显著降低。为明确J链转录是否依赖OBF-1，进而检测对照小鼠OBF-1<'+/+>小鼠和OBF-1<'-/->小鼠脾脏B细胞J链的mRNA表达，两者mRNA水平无显著差别，提示OBF-1<'-/->MRL-lpr小鼠J链的转录抑制可能与lpr和OBF-1的相互作用有关。以上结果表明OBF-1不能在mRNA水平上影响MRL-lpr小鼠抗体分泌细胞的形成。 进而利用流式细胞技术检测分析B细胞发育，结果发现，与OBF-1<'+/+>Fas<'-/->小鼠相比，OBF-1<'-/->MRL-lpr小鼠脾脏和骨髓中的未成熟B细胞(CD19<'+>IgM<'+>)和成熟B细胞(CD19<'+>IgD<'+>)数量没有减少，说明MRL-lpr小鼠OBF-1缺失不影响B细胞的发育。OBF-1<'-/->MRL-lpr小鼠脾脏和淋巴结中CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>T细胞发育未受影响，但CD3<'+>B220<'+>这群T细胞数量却显著降低。结果显示OBF-1<'-/->Fas<'-/->小鼠抗体分泌可能与这群T细胞有关，而可能与B细胞无关。 综上所述，MRL-lpr小鼠OBF-1缺陷可消除自身抗体，抑制狼疮样肾小球炎症，表明OBF-1对自身抗体分泌细胞产生及自身免疫发展具有重要作用，可作为研发治疗红斑狼疮药物有效靶点。

目录

论文说明：缩略语中英文对照表

文献综述转录共激活因子OBF-1与B细胞发育相关研究进展

第一部分OBF-1缺陷MRL-lpr小鼠和OBF-1野生MRL-lpr小鼠模型的建立

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分OBF-1缺陷对MRL-lpr狼疮小鼠抗体分泌细胞产生及自身免疫发展的功能研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

致谢

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