鸡大肠杆菌1型菌毛呈现载体构建及部分功能基因与菌毛表达的相关性研究

摘要

大肠杆菌 1 型菌毛是最常见的大肠杆菌附属物，是一种毛发样蛋白突起，直径5-7nm，长1-2μm，由一个简单重复的多肽(菌毛素)缠绕而成的螺旋中空结构。曾经一度认为 1 型菌毛完全是由菌毛素构成，但目前的研究表明，至少还有三种亚单位参与了菌毛的构成。其中一个亚单位(位于顶端的黏附素)赋予了 1 型菌毛阳性大肠杆菌凝集各种红细胞的能力。这种凝集能够被甘露糖，α-甘露多糖以及某些甘露糖类似物所抑制，表明红细胞上具有甘露糖或甘露糖类似物受体。 1 型菌毛由染色体编码，包含多个基因簇。除了编码菌毛结构蛋白的基因(fimA、fimF、fimG和fimH)外；基因fimB和fimE编码调控蛋白，调节fimA基因的表达，相当于一个控制菌毛表达的开关；另外两个基因fimC和fimD被认为是菌毛跨膜和装配所必需的。 禽源性大肠杆菌与人源性大肠杆菌在基因序列上存在很高的同源性，根据国内外已发表的人源性大肠杆菌 1 型菌毛操纵子基因序列，用DNAStar和Primer 5.0软件分析设计了九条引物，利用PCR技术以 1 型菌毛阳性株YR10(018)基因组为模板，分段扩增fim基因片段BEA、IC、D、D’和FGH，采用酶切、连接、T/A克隆等分子生物学方法将BEA、IC、D分别克隆到pUCl8或pUCm-T载体中，构建了克隆质粒pBEA、pUCm-IC和pUCm-D，其中pBEA包含fimB、fimE和fimA基因，pUCm-IC包含fimI和fimC基因，pUCm-D含有fimD基因。然后利用这些克隆质粒，用相应的限制内切酶及T4 DNA Ligase将各段连接起来，构建质粒pBC和pBD，其中pBC含有基因fimB、fimE、fimA、fimI和fimC，pBD是将片段D连到pBC上，即比pBC多了fimD基因，最后采用SOE PCR方法将D’和FGH连接起来，克隆到pBC上，构建成包含整个1型菌毛操纵子基因的质粒pBH。 将pBC、pBD和pBH分别转化HB101(fim<'->)，经过血凝试验、甘露糖敏感性血凝试验、抗体凝集试验、酵母菌吸附试验及电镜观察发现，重组菌HB101(pBC)不与抗菌毛血清反应，也不表达菌毛；重组菌HB101(pBD)和HB101(pBH)均可以与抗菌毛血清反应，电镜下能够明显看到菌毛，但HB101(pBD)不具有血凝特性，也不能与吸附酵母菌；而HB101(pBH)有明显的血凝特性和吸附酵母的能力，且能够被甘露糖所抑制。 本试验将各重组菌及野生菌之间相互进行了比较，结果发现重组菌HB101(pBH)所表达的菌毛血凝性更强，与抗菌毛血清的凝集反应更明显，吸附酵母的能力更强；而重组菌HB101(pBD)由于缺失了基因fimF，fimG和fimH，因此不具有血凝性，也不能吸附酵母菌，与抗菌毛血清的反应也没有野生菌毛明显，可见，fimF、fimG和fimH虽不是菌毛表达所必需的，但对菌毛的生物学特性有着重要的影响；而重组菌HB101(pBC)与HB101(pBD)相比由于缺失了基因fimD，无法表达菌毛，由此可见基因fimD是1型菌毛表达所必需的。 本研究为构建以大肠杆菌1型菌毛为表面呈现系统的表达载体以及在此基础上研制基因工程疫苗提供了重要条件。

目录

符号说明

第一章1型菌毛的研究进展

一概述

二菌毛的组成及其形态结构

三菌毛的表达

四菌毛的生物学特性

五菌毛的检测方法

六菌毛在感染中的作用

七菌毛基因簇结构

八菌毛的免疫特性

九 1型菌毛作为大肠杆菌表面呈现系统

参考文献

第二章鸡大肠杆菌1型菌毛呈现载体的构建

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第三章鸡大肠杆菌1型菌毛呈现表达与部分功能基因之间的相关性研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文小结

致谢