非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立

摘要

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由 ASF 病毒(ASFV)引起的猪的急性、烈性传染病，以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征，强毒株感染的发病率和死亡率可达100％，对养猪业危害巨大，是各国严密防范的传染病。目前我国尚无本病的发生，但随着国际贸易的增强，国家间人员的流通，在国际机场和港口等地点应严防该病的传入，因此事先建立快速诊断方法十分必要。 VP72是ASFV主要的衣壳蛋白，占病毒粒子蛋白含量的32％，非洲猪瘟病毒是有限的几个不能引起中和反应的病毒之一，但存在针对VP72的中和抗体。并且该蛋白在不同毒株之间高度保守，是诊断ASF最常用的目标抗原。因此通过主要衣壳蛋白VP72建立一种ASF的诊断方法具有可行性。 单克隆抗体特异性强，被认为是鉴定病毒因子的可靠方法，与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应，已用于多种病毒感染的诊断。 为了制备特异的单克隆抗体，本研究使用重组大肠杆菌表达的GST-VP72融合蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠，三次免疫后取脾脏B细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的可溶性GST-VP72S为包被抗原，用间接ELISA方法筛选阳性克隆同时筛除抗GST阳性克隆，获得了五株稳定分泌VP72特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经抗体亚类鉴定试剂盒鉴定分泌的单克隆抗体为IgG2b，腹水效价可达2<'16>。 用GST-VP72S融合蛋白包被ELISA反应板，经方阵滴定法确定碳酸盐缓冲液(pH9.6)的包被效果优于PBS和生理盐水，37℃/2h与4℃/过夜的包被效果差异不大，最佳包被抗原浓度为4μg/ml，5％脱脂乳4℃过夜的封闭效果优于含10％小牛血清的PBST和1％BSA，用含0.5％Tween-20和0.5M NaCl的PBS洗涤液可增强反应特异性和灵敏性，腹水单抗的工作浓度为1：800，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的工作浓度为1：1000，建立的检测ASFV抗体的间接ELISA具有较高的特异性和灵敏性。该酶标板在4℃至少可以保存7天，-20℃至少可以保存60天。

目录

论文说明：符号说明

文献综述

研究内容一：非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

研究内容二：检测非洲猪瘟抗体ELISA方法的建立

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献二

小结

致谢