重组沙门菌表达结核分枝杆菌保护性抗原ESAT-6、CFP-10及其黏膜免疫机理研究

摘要

结核病(Tuberculosis，TB)由来已久，自有人类历史记录开始，就有了TB的记录。迄今为止，约2亿人被TB夺去生命，而这个数字仍在上升，世界卫生组织宣布TB是人类目前面临的最大威胁之一。1882年，Robert Koch证实了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是TB的病原。全世界已有1／3人口约20亿人感染了MTB，现有结核病人2千万，每年新发病人数约880万，每年死亡人数高达160万。目前广泛用于预防TB的唯一疫苗是卡介苗(Bacille Calmette Gu érin，BCG)，但其免疫保护效果对于肺结核及弥散性结核分别约为50％和80％，存在显著差异。TB野毒株的高度耐药以及与人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)共感染的不断上升，使TB警戒再次升高，并强调要利用免疫手段来控制TB的感染和传播。 TB特异性免疫应答在清除MTB感染中发挥重要作用。BCG对青少年TB的预防具有重要的作用，但对于成人肺结核的保护作用有限，因此在设计新型抗结核疫苗时要考虑到如何预防肺结核。基因组学比较分析显示BCG中要比MTB缺失约100多个编码序列，其中的一些序列编码重要的抗原，当这些抗原被重新重组入BCG中都能够增强抗结核的能力。BCG中缺失RD1(Regions of difference 1)，而RD1中的编码基因esxB和esxA基因分别编码培养滤液蛋白10(Culture filter protein 10，CFP-10)和早期分泌抗原靶6(Earlier secreted antigen target 6，ESAT-6)，它们仅存在于临床分离的致病性MTB及牛分枝杆菌野毒株(M．bovis)，能够诱导有效的Th1应答，并在动物实验中显示其对TB的保护效力，因而成为TB免疫诊断以及疫苗研究中最有力的候选抗原。 为此，本研究以沙门菌及其鞭毛蛋白为载体，原核表达并运送ESAT-6、CFP-10蛋白，经滴鼻免疫，探讨了MTB保护性抗原ESAT-6和CFP-10蛋白诱导的黏膜免疫机理。 1.结核分枝杆菌ESAT-6、CFP-10蛋白的克隆、表达及免疫原性分析为分析结核分枝杆菌分泌性抗原ESAT-6和CFP-10蛋白的免疫原性，利用PCR扩增了ESAT-6、CFP-10编码基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建了原核表达质粒pBCX-esat及pET-cfp。将两质粒分别转化宿主菌BL21(DE3)，进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明，重组的ESAT-6和CFP-10蛋白均获表达，融合蛋白的大小分别约为39kD和19kD。将CFP-10与本室研制的针对CFP-10蛋白的单克隆抗体6E8进行Westem-blotting分析。结果显示，CFP-10融合蛋白能与特异性单克隆抗体6E8反应。同时，在ELISA实验中，重组ESAT-6蛋白与医院结核病人血清呈阳性反应。将ESAT-6及CFP-10融合蛋白分别以腹腔注射免疫C57BL/6小鼠，并于第二次免疫后7d，取小鼠脾脏细胞，用胞内细胞因子染色法检测ESAT-6及CFP-10蛋白特异性CD4+T细胞分泌的IFN-γ及IL-4。结果两组蛋白均能诱导较高水平的IFN-γ，而IL-4水平低于IFN-γ水平。此外，经检测脾脏中CD3+T细胞的CD69分子表达发现，ESAT-6和CFP-10蛋白免疫组的CD69水平显著上调。从而说明重组ESAT-6和CFP-10蛋白具有良好的免疫原性；免疫小鼠后，能够激活CD3+T细胞，并诱导以细胞免疫为主的Th1应答，即重组蛋白ESAT-6及CFP-10具有Th1免疫原性。 2.重组沙门菌表达的ESAT-6、CFP-10及其特异性免疫应答分析为了分析重组沙门菌诱导ESAT-6及CFP-10蛋白特异性免疫应答，将ESAT-6及CFP-10蛋白编码基因分别插入原核载体pYA3333中，将构建正确的质粒分别命名为pYA33-esat和pYA33-cfp。通过电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550，获得重组菌X4550(33-esat)和X4550(33-cfp)。以每只1×108cfu剂量的重组菌滴鼻免疫C57BL／6小鼠，间隔18d，在进行第2次免疫后10d取免疫小鼠脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph node，MLN)及派伊尔氏结(Peyer's patches，PP)细胞，以ESAT-6和CFP-10蛋白作为刺激原，检测抗原特异性的IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞。结果表明，经沙门菌表达运送的结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10均能诱导特异性的免疫应答。在肺脏及PP细胞中，检测到较高水平的IFN-γ分泌细胞，与IL-4分泌细胞比较，差异显著。在脾脏和MLN中，免疫应答呈现平衡状态，IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞数量相当。此外，对脾脏、MLN、PP及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BAF)细胞中的共刺激分子检测结果表明，两组重组菌均能上调共刺激分子的表达。利用ELISA分别在免疫鼠的血清和BAF／肠黏膜中检测到ESAT-6及CFP-10蛋白特异性的IgG和IgA抗体。从而表明，以滴鼻方式接种重组减毒沙门菌，能够诱导ESAT-6及CFP-10蛋白特异性的细胞免疫应答，在黏膜邻近器官组织中，免疫应答趋于细胞免疫，而在黏膜远端免疫器官和组织中，免疫应答则处于平衡状态。以滴鼻免疫重组菌，不仅能诱导有效的体液免疫还可以激发局部的黏膜免疫，这为呼吸道疾病的防控提供了新的依据。 3.沙门菌鞭毛蛋白嵌合表达的ESAT-6及其免疫学特性分析为研究以沙门菌鞭毛系统作为运送载体诱导的ESAT-6特异性免疫应答，利用overlap PCR将ESAT-6蛋白编码基因插入沙门菌鞭毛蛋白基因fliC的高变区域，构建成嵌合鞭毛片段fliC／esat。将fliC／esat片段插入原核表达载体pET，构建的质粒命名为pET-fliC／esat。将质粒pET-fliC／esat通过电穿孔法转化沙门菌LB5000，重组菌命名为LB5000(fliC／esat)。用P22噬菌体介导LB5000(fliC／esat)向都柏林沙门菌SL5928的转导，利用PCR、动力学检测及凝集试验鉴定并获得阳性转导菌SL5928(fliC／esat)。将转导菌SL5928(fliC／esat)感染结肠癌细胞HT-29，证实转导菌具有良好的感染能力；黏附力试验证实，转导菌具有良好的黏附特性。利用RT-PCR技术检测转导菌SL5928(fliC／esat)感染BMDC、F4／80+MΦ和肠上皮细胞(Enterocyte，EC)后的TLR-5 mRNA表达，结果在3h时，三种细胞就能表达TLR-5mRNA;至6h，TLR-5 mRNA表达量有所升高。在体内实验中，将转导菌以每只1×107cfu滴鼻免疫C57BL／6小鼠，并于第二次免疫后10d，检测脾脏、肺脏、MLN、PP及鼻咽相关淋巴结(Nasopharynx associated lymph node，NALT)细胞中的IFN-γ和IL-4分泌细胞数。 4.嵌合鞭毛蛋白fliC／esat与BCG黏膜共免疫诱导的免疫应答分析为研究嵌合鞭毛蛋白在TB免疫的中作用，将原核表达质粒pET-fliC／esat及pET-fliC转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嵌合蛋白fliC／esat及鞭毛蛋白fliC。SDS-PAGE分析结果表明，嵌合蛋白及fliC蛋白均以可溶性表达，大小分别约为64kD和57kD。将嵌合蛋白和fliC蛋白分别进行Western-blotting分析，以鼠伤寒沙门菌全菌血清作为一抗，结果显示嵌合蛋白及fliC蛋白均能与多抗血清反应。与ESAT-6蛋白相比较，嵌合蛋白及鞭毛蛋白fliC在体外均能诱导BMDC成熟。体外刺激F4／80+MΦ细胞实验表明，ESAT-6蛋白、fliC蛋白及嵌合蛋白均能上调腹腔MΦ共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54。三种蛋白刺激BMDC及分选的F4／80+MΦ细胞分泌IL-12p70的检测结果显示，在刺激BMDC时，与ESAT-6蛋白组相比较，嵌合蛋白能够诱导分泌较高水平的IL-12p70；而在刺激F4／80+MΦ细胞时，与对照相比较，三种蛋白刺激后，F4／80+MΦ细胞均不能分泌有效的IL-12p70。在体内实验中，用嵌合蛋白静脉注射免疫C57BL／6小鼠，结果嵌合蛋白免疫组能够显著增强ESAT-6特异性免疫应答，而且免疫应答以Th1为主。此外，将BCG与嵌合蛋白共滴鼻免疫发现，在肺脏、PP、NALT及脾脏中均能诱导显著的Th1应答，与嵌合蛋白单一免疫组相比较，BCG能够增强ESAT-6特异性的免疫水平。检测CD8+CD69+细胞结果表明，BCG与嵌合蛋白共免疫组的CD8+CD69+细胞百分数均高于单独BCG及嵌合蛋白免疫组。从而说明，鞭毛嵌合表达ESAT-6抗原，有利于增强ESAT-6的特异性应答，鞭毛蛋白对ESAT-6抗原具有佐剂作用。BCG与嵌合蛋白共免疫结果提示，BCG与嵌合ESAT-6抗原的鞭毛蛋白之间具有协同作用，能够提高ESAT-6特异的免疫应答水平。

目录

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摘要

综述一不同类型免疫应答在疾病中的重要作用

综述二结核分枝杆菌和沙门菌免疫研究进展

第一章结核分枝杆菌分泌性抗原ESAT-6、CFP-10克隆、表达及免疫原性分析

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第二章重组沙门菌表达的ESAT-6、CFP-10及其特异性免疫应答分析

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第三章沙门菌鞭毛蛋白嵌合表达的ESAT-6及其免疫学特性分析

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第四章嵌合鞭毛蛋白fliC/esat与BCG黏膜共免疫诱导的免疫应答分析

1.材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

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