Ⅱ型菊酯类农药广谱特异性抗体的制备和多残留免疫技术建立

摘要

拟除虫菊酯类农药由于具有较高的杀虫活性和低的哺乳动物毒性，被广泛应用在农业、林业、畜牧业及家庭卫生中。尽管拟除虫菊酯类农药对于人类是相对安全的，但如果拟除虫菊酯类农药大量的暴露，则会引起对人类免疫系统的危害，如造成淋巴结和脾脏的伤害甚至于癌变，因为这些潜在危害的存在，建立一种灵敏、快速、有选择性的拟除虫菊酯类农药残留检测方法是十分必要的。免疫学检测技术是农药及其代谢物重要的快速分析方法之一，具有灵敏度高，特异性强等特点。本文进行了Ⅱ型菊酯类农药免疫学检测技术的研究，主要研究结果如下： 1.利用高锰酸钾氧化，将氯氰菊酯原药分子结构中环丙烷部分的双键结构打开，引入-COOH活性基团，设计合成了模拟氯氰菊酯特征结构的半抗原(RS)-α氰基-3-苯氧基苄基(RS)-cis,trans-2，2-二甲基-3-羧基-环丙烷羧酸酯；利用活性酯法将半抗原与牛血清蛋白和卵清蛋白进行偶联，制备人工抗原。半抗原通过核磁共振、红外光谱扫描、高分辨质谱等鉴定，人工抗原通过紫外吸收扫描法鉴定，证明半抗原和人工抗原均为设计所需产物。 2.以半抗原-BSA和半抗原-OVA作为免疫原，免疫新西兰大白兔，获得了多克隆抗体，经间接非竞争ELISA法检测表明以半抗原-BSA免疫兔子制备的抗血清效价达1：25600，利用方阵滴定法确定了包被原与抗血清的工作浓度：包被原的工作浓度为0.5μg/ml，抗血清稀释度为1：12000。 3.用抗血清建立了间接竞争ELISA(IC-ELISA)检测方法。确定了IC-ELISA检测方法中助溶剂丙酮的使用量应小于5％。以IC-ELISA法检测免疫原，结果表明该抗体对免疫原有很好的识别作用，免疫原对的抗体的I50为0.048μg/ml。该抗体对小分子农药氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯都有识别作用，特别是对氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯的灵敏度较高，两者的150分别为1.1553μg/ml和1.7095μg/ml，I10分别为0.0117μg/ml和0.0485μg/ml。

目录

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第一章文献综述

1.1拟除虫菊酯类农药的残留危害

1.2拟除虫菊酯类农药残留分析检测技术

1.2.1薄层色谱法

1.2.2气相色谱(GC)分析法

1.2.3高效液相色谱(HPLC)分析法

1.2.4色谱-质谱联用法

1.2.5酶联免疫吸附剂测定(ELISA)分析法

1.3免疫技术专论

1.3.1免疫检测分析原理

1.3.2免疫分析技术的一般程序

1.4选题的目的和意义

第二章人工抗原的合成及鉴定

2.1材料与仪器

2.1.1试剂材料

2.1.2试验仪器

2.1.3透析袋的准备

2.2试验方法

2.2.1半抗原的合成

2.2.2半抗原的纯化

2.2.3人工抗原的合成

2.2.4人工抗原的的紫外吸收扫描鉴定

2.3结果与分析

2.3.1半抗原分子结构的鉴定

2.3.2人工抗原的紫外鉴定结果

2.4讨论

第三章多克隆抗体的制备与鉴定

3.1材料与仪器

3.1.1主要试剂

3.1.2试验仪器

3.1.3试验动物

3.2试验方法

3.2.1免疫原乳化方法

3.2.2动物免疫方法

3.2.3抗体的分离

3.2.4抗体的鉴定

3.3结果与分析

3.3.1抗体效价的监测

3.3.2抗体及包被原工作浓度的确定

3.4 讨论

3.4.1免疫方案的设计

3.4.2 ELISA方法的选择

第四章酶联免疫分析检测方法的建立

4.1材料和仪器

4.1.1主要试剂

4.1.2试验仪器

4.1.3农药标准溶液

4.2试验方法

4.2.1间接竞争ELISA(IC-ELISA)的建立

4.2.2有机溶剂对IC-ELISA检测的影响

4.2.3 IC-ELISA敏感度及特异性的测定

4.3结果与分析

4.3.1间接竞争ELISA(IC-ELISA)的建立

4.3.2有机溶剂对IC-ELISA法的影响

4.3.3抗体敏感度及特异性的检测

4.4讨论

4.4.1有机溶剂的选择

4.4.2抗体敏感度及特异性分析

全文总结

参考文献

附录

致谢