兔出血症病毒结构基因在重组腺病毒系统中的表达及其免疫原性

摘要

兔病毒性出血症(RHD)是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)引起的兔的传染性疾病，病程短，死亡率高，可造成养兔业的巨大经济损失。VP60蛋白是RHDV唯一的结构蛋白，在动物体内可诱导产生中和抗体，与免疫反应直接相关。目前广泛使用的RHDV疫苗为组织灭活苗，虽然长期以来一直具有良好的免疫效果，但其自身具有不可避免的种种缺陷。由于兔病毒性出血症病毒在体外组织细胞的培养方法尚未建立，所以近年来，人们对RHDV疫苗的研制主要着眼于基因工程苗的研制，其既能起到免疫预防作用，又能很好的解决组织灭活苗的种种缺陷。因此，本研究利用RT-PCR技术把VP60基因克隆入腺病毒表达载体系统中，构建成重组腺病毒，使VP60基因获得表达，并研究其抗原性和免疫原性，以期为研究RHDV重组腺病毒疫苗奠定基础。 本研究据GeneBank数据库德国标准株的基因序列(M67473)，设计合成了一对针对VP60基因的特异性引物，在上游引物的5’端加入Kpn I酶切位点和起始密码子，下游引物的5’端加入Xho I酶切位点和终止密码子。用RT-PCR技术从上海RHD兔的肝脏内扩增出大小为1740bp的PCR产物，经纯化后与PMD19-T载体连接，转化DH5α，然后在氨苄抗性(Amp+)平板上挑取阳性菌落，过夜培养，提取质粒，经Kpn I和Xho I双酶切鉴定后进行DNA序列测定。用DNAStar软件分析结果表明：扩增片断与预期片断大小相符，完全符合载体阅读框。该株VP60基因序列(命名为SH-VP60)与国内外其它分离株同源性为90.2％～98.2％。将目的基因亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV，得到重组质粒pShuttle-VP60，转化到宿主菌E.coli DH5α中，提取阳性克隆质粒，与骨架载体pAdEasy-1按一定比例混合，通过电转化转入E.coli BJ5183中，使它们在E．coli BJ5183中发生同源重组，从而使所克隆入穿梭载体内的VP60基因进入腺病毒骨架载体。转化后的E．coli BJ5183经卡那霉素筛选得到阳性重组质粒pAd-VP60。Pac I酶单酶切线性化后，在脂质体转染试剂介导下，转染HEK293细胞，转染后观察细胞病变，当出现明显的细胞病变时，收获病毒。经IFA、SDS-PAGE和Western-blotting等鉴定，重组腺病毒VP60蛋白(约60KDa)在HEK293细胞中得到表达。 利用重组腺病毒表达的RHDV衣壳蛋白接种免疫2月龄以上非RHD免疫兔，结果显示该表达的重组衣壳蛋白在免疫后22天可以诱导兔体产生抗RHDV抗体，其诱导的血凝抑制抗体效价介于24至27之间。该抗体可以提供足够的免疫保护力以抵抗血凝价为210以上的致死剂量RHDV强毒的攻击。

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摘要

引言

文献综述 兔病毒性出血症病毒(RHDV)研究进展

1 RHDV的概况

2 RHDV的分子生物学研究进展

3 RHDV的诊断与检测

4 RHDV的免疫与基因工程疫苗进展

参考文献

第一章RHDV VP60基因的克隆与序列分析

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二章RHDV VP60蛋白的表达及检测

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三章重组腺病毒表达的RHDV衣壳蛋白的免疫原性研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

致谢