乳中IgA和IgM含量的变化及其影响因素的机理研究

摘要

本试验由四部分组成，主要研究了初乳、常乳和免疫乳血清和乳清中各免疫球蛋白含量的变化规律及其乳清中主要蛋白质的SDS-PAGE分析，并研究了牛乳中IeA和IgM浓度的影响因素，包括奶牛胎次、泌乳阶段、产奶量、体细胞评分(SCS)以及奶牛plgR基因5'侧翼区的SNP。以小鼠为试验动物模型来探讨奶牛乳腺中IgA和IgM合成转运的机理，研究了小鼠免疫刺激后plgR基因的表达量及与特异性lgA含量的相关性。具体研究结果如下： 试验一：采用埋植抗原缓释剂ARD这一种新型的免疫乳生产技术。选取2胎牛20头，按照泌乳天数、产奶量相近的原则随机分成2组，每组10头，其中10头用于埋植ARD(试验组)，其余为对照(对照组)。采集每头牛的乳样和血样。同时采集奶牛产后0-7 d的初乳乳样(n=20)和产后1 d和5 d的血样。采用夹心ELISA测定血清和乳清中的免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的含量。结果表明免疫组奶牛的血清和乳清中的各免疫球蛋白的含量均高于对照组。其中乳清中IgG的含量在9 d、17 d和32 d分别达到最高峰，这与ARD在埋植后0 d、14 d和28 d释放相一致。相反，乳清中的IgA和IgM的含量没有表现出相同的规律。初乳牛1d的血清中IgM的含量显著高于5 d的含量(p<0.05)，而IgG和IgA的含量无显著差异。初乳乳清的各免疫球蛋白含量随着泌乳天数的增加而迅速下降，直至维持在较低的水平。SDS-PAGE结果表明，从电泳图谱上可以清晰的看见5个条带，自上而下依次是乳铁蛋白、牛血清白蛋白、IgG重链、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。其中32 d的免疫乳和0-3 d的初乳可以看到IgG的轻链，其它样品IgG轻链条带较弱。0-7d初乳各乳清蛋白的相对含量随着泌乳天数增加而逐渐下降，在0-5d内差异显著(p<0.05)，直至维持在较低水平。免疫乳15 d和32 d各乳清蛋白均高于常乳。 试验二：研究了正常泌乳奶牛中IgA和IeM的浓度是否受奶牛胎次、泌乳阶段、产奶量和牛奶体细胞评分(SCS)的影响。从1600多头奶牛群体中随机选择284头奶牛采集其牛奶样品，通过夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定其IgA和IgM的浓度。牛奶中IgA和IgM的浓度(平均数±标准差，对数形式，下同)分别为2.371±0.286和1.499±±0.383。4胎以上(含4胎)的奶牛其乳中IgA平均浓度高于1胎、2胎和3胎牛，而3胎牛和4胎牛其乳中IgM的平均浓度差异显著(p<0.05)；IgA浓度在泌乳前期和泌乳中期较低，而IgM浓度随着泌乳天数的增加而增加；产奶量为20-25kg和大于30 kg的奶牛其乳中IgA含量较低，但是产奶量并不影响IgM含量；牛奶中IgA和IgM含量都随着SCS的增加而增加。相关分析和通径分析表明，这些因素对牛奶中IgA和IgM的累积效应值分别达到了0.320和0.358。 试验三：从NCBI上的Map Viewer数据库下载牛plgR基因的5'侧翼区的序列(Nw 174143)，长度为3.2 kb，设计4对引物进行PCR扩增，通过对25头牛的PCR产物直接测序发现SNP位点，采用SNP Stream标签微列阵基因分型系统对189头牛进行基因分型，将其与牛奶和血液中的IgA和IgM的含量进行关联分析。结果表明，在基因-3128、-3072、-2834、-2348和-515位发现了5个SNP位点，其中SNPl和SNP2为A/G突变，SNP3、SNP4和SNP5为T/C突变。方差分析结果表明，SNP1对牛奶IgM和血液IgA含量有显着的影响(p<0.05)，SNP3和SNP5对血液IgM含量有显着影响(p<0.05)，其它SNP位点与单倍型组合对乳及血液中IgA和IgM的含量均没有显著影响(p<0.05)；多重比较分析表明，SNP1位点的基因型AB个体与BB个体的牛奶IgM和血液IgA含量的最小二乘均数差异显著(p<0.05)；SNP3和SNP5的不同基因型对血液IgM含量的最小二乘均数分别达到了显著水平(p<0.05)。因此，从研究结果可以看出奶牛okgR基因5'侧翼区的多态性影响牛奶和血液中的IgA和IgM的含量，这为进一步研究牛奶中IgA和IgM分泌转运机理提供了一定的理论依据。 试验四：本试验以小鼠为试验动物来研究乳中IgA的产生转运机理。选择48只健康昆明小白鼠，分为A、B、C、D组，分别于分娩后第4d注射以下四种疫苗：灭菌生理盐水、Lipase+灭菌生理盐水、空ISCOM和Lipase+ISCOM，每组注射12只，并于分娩后8 d和12 d(即注射后4 d和8 d)采集各小鼠乳样、血样和乳腺组织，用间接ELISA法测定乳样和血浆中的特异性IgA含量，用Real TimePCR检测小鼠乳腺中pIgR基因的相对表达量。结果表明，血浆中特异性IgA的含量差异不显著，而B组和D组中分娩后12 d的乳中特异性IgA含量显著高于8 d乳中的特异性IgA含量(p<0.05)，Real Time PCR相对定量结果也表明，B组和D组在分娩后12 d的乳腺中pIgR基因的表达量上升。因此，乳腺中pIgR基因表达量增加可以提高乳中特异性IgA的水平，这表明pIgR参与介导IgA跨膜分泌进入乳中，pIgR的数量影响乳中IgA的含量。

目录

论文说明：论文缩略词表

声明

摘要

第一章前言及文献综述

1牛奶中的免疫球蛋白研究进展

1.1免疫球蛋白的基本结构和功能

1.2血液及乳中的免疫球蛋白种类及含量

1.3乳品加工技术对乳中免疫球蛋白的影响的研究进展

1.4乳中免疫球蛋白含量的影响因素

2动物多聚免疫球蛋白受体(pIgR)研究概况

2.1多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的分子结构

2.2多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的生物学功能

2.3动物多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的研究概况

3本研究的意义

第二章初乳、常乳和免疫乳中的免疫球蛋白含量的变化规律及其SDS-PAGE分析

1试验目的及意义

2材料与方法

2.1抗原缓释剂ARD

2.2试验奶牛饲养管理及样品的收集

2.3乳清和血清中免疫球蛋白的测定

2.4 SDS-PAGE电泳及相对定量分析

2.5统计分析

3结果与分析

3.1 ARD埋植后血清和乳清中的免疫球蛋白含量的变化规律

3.2初乳中的免疫球蛋白含量的变化规律及其与免疫乳的比较

3.3免疫球蛋白的相关性分析

3.4 SDS-PAGE电泳及其相对定量分析

4讨论

4.1ARD埋植后血清和乳清中的免疫球蛋白含量的变化规律

4.2初乳中的免疫球蛋白含量的变化规律及其与免疫乳的比较

4.3免疫球蛋白的相关性分析

4.4 SDS-PAGE电泳及其乳清中主要蛋白的相对定量分析

5结论

第三章正常泌乳奶牛其乳中IgA和IgM含量的影响因素研究

1试验目的及意义

2材料与方法

2.1试验奶牛的选择

2.2样品的采集和体细胞数(SCC)的测定

2.3夹心ELISA测定乳中IgA和IgM的含量

2.4数据处理与统计分析

3结果

3.1正常泌乳奶牛乳中IgA和IgM的含量和分布

3.2奶牛胎次对乳中IgA和IgM含量的影响

3.3奶牛泌乳阶段对乳中IgA和IgM含量的影响

3.4奶牛日产奶量对乳中IgA和IgM含量的影响

3.5体细胞数评分(SCS)对乳中IgA和IgM含量的影响

3.6对各影响因素进行多元回归分析和通径分析

4讨论

4.1胎次对乳中IgA和IgM浓度的影响

4.2泌乳阶段对乳中IgA和IgM浓度的影响

4.3产奶量对乳中IgA和IgM浓度的影响

4.4 SCS对乳中IgA和IgM浓度的影响

4.5对各影响因素进行多元回归分析和通径分析

5结论

第四章多聚免疫球蛋白受体基因5'侧翼区的SNP检测及其与牛奶和血液中的IgA和IgM含量的相关性研究

1试验目的及意义

2材料与方法

2.1样品采集及DNA的提取

2.2血液和牛奶中IgA和IgM含量的ELISA检测

2.3主要试剂

2.4 PCR扩增、纯化后测序发现并确定SNP位点

2.5 SNP Stream进行基因分型

2.6统计分析

3结果与分析

3.1 DNA提取效果及PCR扩增结果

3.2 PCR产物测序分析发现SNP位点

3.3基因型频率、单倍型和单倍型组合频率

3.4不同SNP位点、单倍型组合与IgA和IgM含量的关联分析

4讨论

5结论

第五章小鼠免疫刺激后乳腺中pIgR基因mRNA的表达及特异性IgA含量的变化

1试验目的及意义

2材料与方法

2.1小鼠及饲养管理

2.2试验设计

2.3样品采集

2.4分子生物学主要试剂耗材及仪器设备

2.5检测指标及方法

2.6数据统计分析

3结果与分析

3.1小鼠乳腺总RNA的提取效果及其引物的PCR检测

3.2小鼠乳腺中特异性IgA含量的变化

3.3小鼠乳腺中pIgR基因的mRNA的表达量

4讨论

4.1小鼠血浆和乳中特异性IgA含量的变化

4.2小鼠乳腺中pIgR基因的mRNA表达量的变化

5结论

参考文献

总结论

本文创新点及后续研究思路

附录

致谢

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