巨型艾美球虫NT株gam82基因表达载体的构建及其免疫保护性试验

摘要

本研究对巨型艾美球虫南通株(E.maxima Nantong strain)配子体gam82基因进行了克隆、序列分析、原核表达和核酸疫苗的构建，并对重组蛋白与核酸疫苗在鸡体内的免疫保护作用进行了初步的试验，为在临床上利用重组疫苗控制鸡球虫病奠定基础。 1、E.maxima NT株gam82基因的克隆与序列分析 以E.maxima NT株纯化的配子体提取的总RNA为模板，设计特异性引物，应用RT-PCR技术扩增出gam82基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-TEasy载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经蓝白斑筛选、酶切鉴定为阳性的克隆进行测序验证。结果显示，克隆的基因全长为1791个核苷酸，具有一个完整的开放阅读框，编码596个氨基酸，其序列与E.maxima Houghton株的完全一致。用Predicting Antigenic Peptides预测软件分析gam82基因编码区的抗原性，显示存在19个抗原决定簇，其中酪氨酸富集区所在的第282～503位氨基酸具有抗原位点达8个之多(在本研究中命名为gam82-Y区)。 2、E.maxima NT株gam82基因的原核表达 根据E.maxima NT株gam82抗原基因Y区的cDNA序列设计1对引物，经PCR从阳性质粒模板中扩增出目的片段。该基因片段经酶切回收后按正确的阅读框架克隆入大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游，构建重组表达质粒pGEX-6P-1-gam82-Y，并经测序验证。重组菌经过IPTG诱导后，通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测，gam82-Y基因片段在大肠杆菌中得到了融合表达，分子量约为53 Ku。可溶性分析表明，融合蛋白主要以包涵体形式存在。以E.maxima高免血清为一抗进行Western-blot检测，显示重组抗原gam82-Y具有免疫原性。 3、E.maxima NT株gam82基因核酸疫苗的构建 以已构建的重组质粒pGEM-T-gam82为模板，用含有EcoRI和Hind III酶切位点的1对特异性引物扩增出gam82基因的ORF片段。将扩增片段插入pcDNA3.1载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经Amp抗性筛选阳性克隆，提取重组质粒后用EcoRI和Hind III双酶切鉴定，并测序验证重组质粒中am82基因阅读框架的正确性。采用MTT法与ELISA对构建的重组质粒pcDNA3.1-gam82接种鸡体后淋巴细胞增殖与抗体水平的变化进行了检测，结果显示该核酸疫苗具有一定的免疫原性。 4、重组蛋白gam82-Y和核酸疫苗pcDNA3.1-gam82的免疫保护效果 以黄羽肉鸡为试验动物，设计了2个试验，以平均增重、相对增重率与相对卵囊产量等为评价指标，分别对重组蛋白和核酸疫苗的免疫保护效果进行了初步研究。结果显示：中剂量重组蛋白佐剂组和重组蛋白中剂量组的免疫保护力低于卵囊免疫组(P<0.05)，但好于其他各免疫组(P<0.05)；核酸疫苗(pcDNA3.1-gam82)组在增重、卵囊减少率等方面相同于重组蛋白免疫组，两组均好于未免疫攻虫组(P<0.05)，但仍未能达到卵囊免疫组的免疫保护水平(P<0.05)。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

文献综述：鸡球虫病亚单位疫苗与基因工程疫苗的研究进展

1 亚单位疫苗

2 合成肽疫苗

3 基因工程疫苗

3 总结与展望

参考文献

第一章巨型艾美球虫NT株gam82基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

参考文献

第二章巨型艾美球虫NT株gam82基因的原核表达

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

参考文献

第三章巨型艾美球虫NT株gam82基因核酸疫苗的构建

1 材料与方法

3 结果

3 小结与讨论

参考文献

第四章重组蛋白gam82-Y和核酸疫苗pcDNA3.1-gam82的免疫保护效果

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

参考文献

全文小结

致谢

攻读学位期间发表的学术论文