奶牛妊娠早期血液中PAG及相关基因表达的研究

摘要

奶牛配种后，尽早地判断其妊娠与否，以便对已妊娠者加强饲养管理，对未妊娠者找出原因，及时补配或进行必要的处理。这对缩短奶牛产犊间隔，提高其繁殖力具有重要意义。本试验分别运用了半定量PCR技术和mRNA差异显示技术，研究了以奶牛血液中PAG基因的表达量为依据的早期妊娠诊断方法以及空怀牛和妊娠牛血液相关基因表达的差异，从分子水平上了解早期妊娠诊断过程中基因表达的变化规律，以期为哺乳动物早期妊娠诊断的新方法研究提供参考。结果如下： 空怀牛和已妊娠21天的妊娠牛血液中PAG基因均有表达，妊娠牛PAG基因表达量略高于空怀牛，但是两者差异不显著，t=2.36950.05。这也就说明配种后21天奶牛血液中PAG基因的表达量不能被作为妊娠早期诊断的依据。 在妊娠母牛血液中共筛选到了6条分别特异表达的片段，经过测序及对比分析，表明有3条带与已知的功能基因或调控基因相似，其余条带为未知功能基因或无相似基因。其中：S1序列与转化因子TGF-β2具有较高的同源性(98％)，TGF-β2对牛滋养层和子宫内膜上皮有促进增生的作用，而对上皮细胞生长和倾入滋养层有抑制作用；TGF-β2还对转型变异的人子宫内膜和家畜上皮有促增长作用。S4序列与集刺落因子1有较高的同源性(97％)，CSF能刺激早期胎盘生长，还能抑制NK细胞的功能，减少流产的发生。S5序列与胰岛素生长因子具有较高的同源性(98％)，IGF主要通过膜受体起作用，可刺激胎盘促乳素的释放，调节其它类固醇激素的合成与分泌。IGFs与胚泡植入、胎盘形成和功能、胎儿生长发育有关，具有促进滋养细胞浸润、利于胚胎着床等作用；参与了早期妊娠多个环节的调节，是胚胎发育的重要影响因子。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

文件综述

1妊娠结合糖蛋白

1.1 PAG的发现

1.2 PAG的分子结构和作用机制

1.3 PAG的研究现状

2.半定量PCR

3.mRNA差异显示技术的原理与方法

3.1 mRNA差异显示技术的原理与优点

3.2 mRNA差异显示技术的不足

3.3 mRNA差异显示技术的改进和发展

4.本研究的目的和意义

实验部分：部分一PAG mRNA在奶牛血液中的表达

1材料与方法

1.1主要仪器及设备

1.2实验材料

1.3主要试剂与溶液配制

2实验方法

2.1.血液总RNA的抽提

2.2 RT-PCR

2.3 RT-PCR扩增产物的电泳

2.4半定量分析

2.5统计分析

3.结果与分析

3.1样本RNA的完整性与纯度检测

3.2 PAG基因在妊娠及空怀牛血液中的差异表达

3.3 β-action基因在妊娠及空怀牛血液中的差异表达

3.4以β-action为内标对PAG基因表达量的测定结果

4讨论

5结论

实验部分：部分二奶牛妊娠早期血液相关基因差异表达的研究

1材料与方法

1.1主要仪器及设备

1.2实验材料

1.3主要试剂与溶液配制

2实验方法

2.1.血液总RNA的抽提

2.2 RT-PCR

2.3.8％聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4差异片段的回收及二次PCR

2.5连接反应

2.6感受态细胞的制备(CaCl2法)

2.7转化(CaCl2法)

2.8重组质粒的保种和质粒DNA的提取

2.9菌体PCR鉴定

2.10差异表达片段的序列分析

3结果与分析

3.1差异显示PCR的结果

3.2二次PCR产物的克隆转化与鉴定

3.3妊娠奶牛差异条带分析

3.4相似功能的基因片段克隆序列比对结果分析

4.讨论

4.1妊娠牛血液相关基因的表达

4.2 TGFβ-2基因的表达

4.3 CSF-2基因的表达

4.4 IGF-1基因的表达

5.结论

参考文献

附录：差异表达片段的测序结果及序列对比结果

致谢

攻读学位期间发表的学术论文