表达细胞因子和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒的构建及细胞因子的免疫佐剂作用

摘要

疫苗的免疫接种在禽流感(Avian influenza，AI)的控制中起着极为重要的作用，但现有的常规灭活疫苗存在成本高及干扰临床检测等缺陷，开发新型疫苗势在必行。以鸡痘病毒(Fowlpox，FPV)载体表达禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)保护性抗原基因研制基因工程疫苗已发展到相当成熟的程度，但现有的重组鸡痘疫苗都存在着易受母源抗体干扰、免疫保护效果不如灭活疫苗的问题，以细胞因子作为免疫佐剂可能是增加疫苗保护力的有效途径之一。因此，我们利用转移载体p12LS，分别构建了单表达鸡白细胞介素2(IL-2)基因、鸡白细胞介素6(IL-6)基因、共表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因和IL-2基因及共表达AIV HA基因和IL-6基因的四种重组鸡痘病毒，并对细胞因子的免疫佐剂作用进行评估，主要内容如下： 1.表达H5亚型AIV HA基因和IL-2基因的重组鸡痘病毒的构建 以鸡痘病毒为载体，将鸡IL-2基因插入到鸡痘病毒表达载体p12LS启动子Ps下游，构建携带了鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒p12LSIL2;将H5亚型AIV HA基因和IL-2基因分别插入到鸡痘病毒表达载体p12LS启动子Ps和PE/L下游，使两基因反向串联，构建携带AIV HA基因和鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒p12LSH5AIL2。将重组鸡痘病毒转移载体质粒转染至已感染鸡痘病毒wt-FPVLP的鸡胚成纤维细胞(CEF)中，经蓝斑筛选获得纯化的重组鸡痘病毒rFPV-IL2、rFPV-AIH5AIL2。间接免疫荧光试验表明重组鸡痘病毒能够表达H5亚型AIV HA: RT-PCR和间接免疫荧光实验证实了IL-2在重组鸡痘病毒中的表达。 2.表达AIV HA基因和鸡IL-6基因的重组鸡痘病毒的构建 根据NCBI发表的鸡IL-6基因序列，人工合成和拼接获得IL-6基因。构建重组鸡痘病毒转移载体质粒p12LSIL6、p12LSH5AIL6。将重组鸡痘病毒转移载体质粒转染至已感染鸡痘病毒wt-FPVLP的鸡胚成纤维细胞(CEF)中，经蓝斑筛选获得纯化的重组鸡痘病毒rFPV-IL6、rFPV-AIH5AIL6。间接免疫荧光试验表明重组鸡痘病毒能够表达H5亚型AIV HA；RT-PCR证实了IL-6在重组鸡痘病毒中的表达。 3.重组病毒的免疫效力试验 7日龄白来航SPF雏鸡随机分组，分别于颈部皮下免疫rFPV-HA、rFPV-HA+rFPV-IL2、rFPV-HA+rFPV- IFN- II、rFPV-AIH5AIL2，同时设wt-FPVLP、rFPV-IL2、PBS和油乳剂灭活苗对照组。于免疫后7，14，21d采血，分离血清检测HI抗体效价。免疫后21d，用剂量为105'5ELD50/只的A/mallard/Huadong/S/2005株进行滴鼻攻毒，攻毒后3d采集喉头棉拭子，用10日龄非免疫鸡胚分离病毒。结果发现rFPV-AIH5AIL2免疫后鸡的抗体水平显著高于rFPV-H5A免疫组；rFPV-H5AIL2组和灭活疫苗组均达到100％的保护，略高于rFPV-HA组及rFPV-IL2+rFPV-HA低剂量联合免疫组；rFPV-AIH5AIL2免疫鸡攻毒后的排毒率为10.5％，是所有免疫组中排毒率最低的。 7日龄商品蛋鸡随机分组，免疫、抗体监测、攻毒、棉拭子采集及病毒分离等均同SPF鸡。结果发现免疫后14d只有rFPV-HA和rFPV-IL2联合免疫组及rFPV-AIH5AIL2组检测到HI抗体，免疫后21 d rFPV-AIH5AIL2组HI抗体水平与灭活疫苗组相当，显著高于rFPV-HA组。rFPV-AIH5AIL2的保护指数为50％，略低于灭活疫苗，但显著高于rFPV-HA组。rFPV-AIH5AIL2免疫鸡攻毒后的排毒率为36.4％，也是所有免疫组中排毒率最低的。 综上所述，本研究共构建4种重组鸡痘病毒，免疫效力试验显示重组鸡痘病毒rFPV-AIH51L2在SPF鸡上具有理想的免疫保护作用；在有较高水平的母源抗体的商品蛋鸡上，重组病毒也具有较好的保护效力。研究结果表明IL-2在共表达重组鸡痘病毒免疫保护中起到了免疫佐剂的作用，这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。

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综述：禽流感疫苗研究进展

第一章表达鸡IL-2基因及共表达IL-2基因和H5亚型AIVHA基因重组鸡痘病毒的构建

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二章表达鸡IL-6基因及共表达IL-6基因和H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒的构建

1材料

2方法

3结果

4.讨论

第三章重组病毒的免疫效力比较

1材料与方法

2.结果

3.讨论

全文小结

参考文献

附录图一 鸡IL6基因测序峰图

致谢

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