基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及其单克隆抗体研制

摘要

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni，C.jejuni)是全球范围内主要的细菌性肠道病原菌，同时也是一种重要的食源性病原菌。除引起人的急性、自限性腹泻外，特定血清型的空肠弯曲菌感染可能导致严重的全身继发症，如格林-巴利综合症(GBS)。人空肠弯曲菌病散发病例主要是由于食用污染的鸡肉，因此，鸡群中空肠弯曲菌流行病学的调查结果非常有意义。传统的细菌流行病学调查虽然具有良好的特异性，但由于空肠弯曲菌的培养条件苛刻，可能出现漏检情况。血清学检测技术操作简单、敏感性高，是病原微生物感染检测的重要手段。本研究通过表达空肠弯曲菌cjaA基因，纯化重组蛋白His-CjaA、GST-CjaA，以GST-CjaA纯化蛋白为免疫原，His-CjaA为检测原制备针对CjaA的单克隆抗体；同时以纯化的His-CjaA为检测原，建立检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法。
　　 一、空肠弯曲菌cjaA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制
　　 CjaA蛋白是由空肠弯曲菌cjaA基因编码的膜转运蛋白，是空肠弯曲菌的主要保护性抗原。本研究依据GenBank上公布的cjaA基因序列设计引物，扩增目的基因，先将扩增产物构建到pUCm-T载体上经测序鉴定后，分别将目的基因构建到原核表达质粒pGEX-6p-1和pET(30a)上，构建出重组菌BL21(pGEX-6p-1-cjaA)、BL21(DE3)(pET-cjaA)。经IPTG诱导表达，利用亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白His-CjaA、GST-CjaA与预期大小一致。Western-blot试验结果证明融合蛋白具有良好的免疫生物学活性。
　　 融合蛋白GST-CjaA经纯化后，与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，经皮下多点注射免疫，100μg/只。以后每隔2周，取与一免等剂量的免疫原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下注射加强免疫，加强免疫2次，融合前3 d腹腔注射加强免疫1次，100μg/只。按常规程序融合，以纯化蛋白His-CjaA作为检测抗原，间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得3株稳定分泌CjaA单克隆抗体(McAb)的细胞株，分别命名为2B6、3C2、4F11。单抗腹水效价分别为1×105、2×105、4×105。McAb的抗体亚类测定均为IgG1。Dot-ELISA试验表明：3株单抗只与表达CjaA的重组大肠杆菌以及空肠弯曲菌分离株反应，与其它非空肠弯曲菌不反应。Western-blot试验中，3株单抗均能与融合蛋白His-CjaA发生反应，出现特异性条带。CjaA单克隆抗体的成功研制，为进一步研究CjaA蛋白的生物学特性，建立快速检测方法奠定了基础。
　　 二、基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及初步应用
　　 NCBI上BLAST结果显示，13株空肠弯曲菌的cjaA基因之间的同源性在98％以上，与2株结肠弯曲菌的cjaA基因同源性在88-89％之间，与1株乌普萨拉弯曲菌的glnH基因的同源性为82％，与其他所有细菌基因库中基因的同源性在70％以下，显示出高度的保守性和特异性。PCR方法检测200株空肠弯曲菌，cjaA基因的携带率为100％。
　　 以纯化蛋白His-CjaA作为包被原，优化、确定了ELISA反应条件：抗原的最佳包被液为0.05M pH7.6的Tris盐酸缓冲液；抗原最佳包被浓度为18.76μg/ml，封闭液为10％小牛血清，封闭条件为37℃，2h，最佳血清稀释液为5％小牛血清，血清稀释倍数为1∶200，最佳血清作用时间为1.5h，HRP-羊抗鸡IgG的最适工作浓度为1∶10000，最佳酶标二抗作用时间为40min，显色时间为3min。应用优化的方法，对65份阴性血清的检测结果进行统计分析，OD490值大于0.46为阳性判定标准。利用建立的间接ELISA方法对人工感染空肠弯曲菌的鸡进行检测，在第3周时所有40只鸡血清中均能检测到空肠弯曲菌抗体阳性，与常规细菌鉴定方法结果一致。对8个鸡群的450份鸡血清样品进行检测，除1个鸡群血清样品阳性率为51.7％(31/60)外，其他血清样品经检测均为阳性。血清学检测方法的建立为开展空肠弯曲菌流行病学研究提供了新方法，同时为深入研究CjaA蛋白的生物学功能、致病机理提供了一种便利的工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章 空肠弯曲菌检测技术进展

1.基于生化反应的常规检测方法

2.常规检测方法的改良

3.基于免疫学技术的新型检测方法

3.1常规免疫学检测方法

3.2免疫磁珠

3.3电化学免疫传感器

4.基于分子生物学的新型检测方法

4.1核酸探针

4.2 PCR技术

4.3 NASBA技术

4.4 LAMP技术

5.展望

参考文献

第二章 空肠弯曲菌cjaA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1cjaA基因的扩增及重组质粒构建

2.2重组菌表达产物的SDS-PAGE分析

2.3多抗血清效价

2.4表达产物的免疫生物学活性测定

2.5单克隆抗体筛选方法的建立

2.6杂交瘤细胞株的建立

2.7单抗生物学特性

2.8单抗特异性分析

3讨论

参考文献

第三章 基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及初步应用

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.2.1 CiaA蛋白同源性分析

2.2.2 200株空肠弯曲菌中cjaA基因检测结果

2.2.3 His-CiaA阳性血清的制备

2.2.4间接ELISA方法的建立与优化

2.2.5间接ELISA方法操作程序的确定

2.2.6间接ELISA方法阳性临界值的确定

2.2.7特异性实验

2.2.8鸡人工感染空肠弯曲菌抗体测定

2.2.9重复性实验

2.2.10间接ELISA方法的初步应用

3讨论

参考文献

致谢

攻读学位论文期间发表的文章目录