甲型H1N1流感病毒血凝素基因的表达和免疫原性分析

摘要

流感病毒(influenza virus)是引起人类呼吸道感染及引起人类死亡的主要病因之一。人类曾多次遭受过流感病毒大流行(1918年H1N1亚型，1957年H2N2亚型，1968年H3N2亚型，1977年H1N1亚型)。至今人类仍然无法征服流感病毒。快速检测及接种疫苗被认为是控制并清除流感病毒经济有效的手段。实时荧光定量PCR检测流感病毒具有快速、特异性高的特点，但花费昂贵，不适合大面积推广；当前使用的疫苗有流感减毒疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗等，这些疫苗能够在人体中产生保护性抗体，但是都有一定的缺陷，如减毒疫苗具有毒力回复的潜在性危险，而后两种却很难产生细胞免疫应答。因此，迫切需要研制一种快速的检测流感病毒的方法及新型有效的疫苗。
　　 当前发表的许多文章都证实了流感病毒糖蛋白抗原的保护性作用，在这些糖蛋白抗原中，血凝素(HA)的作用相当重要。HA具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒，是主要的保护性抗原。因此，针对HA蛋白的重要性，以GenBank公布的A/California/05/2009H1N1流感病毒HA基因为目的基因，从GenBank数据库中下载HA基因序列，进行全基因合成，将人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到原核表达载体pET30a+上，构建重组表达质粒，并转化E.coli BL21(DE3)，以IPTG对重组菌BL21(DE3)(pET-HA)进行诱导表达，表达产物His-HA融合蛋白通过变复性后纯化。Western blot试验结果表明表达产物His-HA融合蛋白能特异性地与人甲型H1N1流感患者阳性血清反应，证明表达产物His-HA融合蛋白具有免疫反应活性。利用该His-HA融合蛋白的建立检测抗体的ELISA方法，并探究ELISA方法的最适宜条件，ELISA方法的适宜条件为原核表达产物His-HA融合蛋白以1μg/孔包板，检测血清的稀释度为1:80到1:640间；以建立的ELISA检测300份人源血清样品，阳性血清数量为74份，阳性率为24.67％，并与商品化试剂盒进行对比，符合率为98.65％，对比试验说明建立的ELISA方法具有可行性。
　　 将人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到pFastBac1转移载体，转化DH5a，然后在含Kan抗生素的LB平板上挑取阳性菌落，得到的重组转移质粒pFastBac-HA，再提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10Bac中，发生转座作用，在含庆大霉素、卡那霉素、四环素3种抗生素和X-gal/IPTG的LB培养板上，筛选出白色菌落得到重组穿梭载体Bacmid-HA。经PCR鉴定为阳性后，采用阳离子脂质体法转染到Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒，通过IFA、SDS-PAGE及Western blot试验证实在Sf9细胞中HA蛋白得到表达。血凝试验结果表明表达产物HA蛋白血凝价为1:16，血凝试验证实真核表达产物具有生物活性。将真核表达的HA蛋白以100μg/只的剂量，通过皮下注射BALB/c小鼠，探讨其免疫原性，ELISA检测免疫小鼠血清的抗体效价，结果显示，二免14天，HA蛋白免疫组的抗体效价与空白对照组之间呈现显著差异(p<0.05)。HA蛋白免疫小鼠血清血凝抑制试验血凝抑制价为1:16。ELISPOT检测免疫小鼠分泌细胞因子IL-4和IFN-γ脾脏淋巴细胞，结果显示产生IFN-γ的分泌细胞少于产生IL-4的分泌细胞，Prism软件包分析表明，两者存在显著差异(p<0.05)，免疫小鼠体内趋向于Th-2为主的免疫应答。