H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析及F株灭活疫苗的免疫效果评价

摘要

自1994年我国首次报道从鸡群中分离到H9N2亚型禽流感病毒(AIV)以来,该病毒已在我国广泛分布和流行,在混合、继发感染其它疾病或不良的饲养条件下,导致高发病率和死亡率。分析H9N2亚型AIV的流行和抗原变异情况,掌握疫苗的免疫保护效果,了解实际生产中疾病发生的原因,对于有效控制H9N2亚型禽流感(AI)具有重要意义。本研究进行了H9N2亚型AIV毒株的分离鉴定和遗传进化分析,以SPF鸡和商品鸡为试验对象测试常用灭活疫苗(F株)对分离毒株的免疫保护效果。此外,还对某H9N2亚型AI发病鸡场进行了调查。
　　 1 H9N2亚型禽流感病毒流行毒株的分离与鉴定
　　 为了阐明免疫鸡群中H9N2亚型AIV的流行和抗原变异情况,本研究于2009～2010年间在安徽、福建、河南、浙江、吉林等5个省份进行了H9N2亚型AIV的分离,并对分离毒株进行了系统的生物学特性鉴定、血凝素(HA)基因序列测定和遗传进化分析。
　　 9个分离毒株经过4～5代鸡胚培养后,血凝价逐渐稳定在8 log2～10 log2之间;各毒株只能被H9亚型AIV阳性血清抑制,而不能被其它HA亚型AIV阳性血清抑制,也不能被新城疫病毒(NDV)和EDS-76阳性血清抑制;RT-PCR鉴定这些毒株的神经氨酸酶(NA)亚型为N2,说明9个毒株均为H9N2亚型AIV,分别简称为L9、F9、F119、S9、YD、D9、M、W9、D119。这些分离毒株的1日龄SPF鸡脑内接种致病指(ICPI)在0.21～0.45之间;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)在0.33～0.70之间,其中F119、YD、W9的ICPI和IVPI值分别在0.4和0.6以上。
　　 对HA基因的序列测定和比对分析发现,9个分离毒株的HA基因编码区长度均为1683 nt,编码560个氨基酸(aa),HA基因核苷酸序列同源性为90.7～98.9％,氨基酸序列同源性为92.2～98.8‰分离毒株与疫苗毒株(F株)HA之间的核苷酸序列同源性为91.6～99.6％,氨基酸序列同源性为92.9～99.3％;9个分离毒株与F株均属于Beijing/1/94-like进化分支,但分属于3个不同的基因亚型;流行毒株在免疫压力下已经发生一定的遗传漂变。与疫苗F株相比,F119、S9、YD、D9、M、W9和D119等7株病毒的抗原位点C、D和E都出现了氨基酸突变。这些位点的突变可能导致了病毒抗原性变化,从而影响F株疫苗的免疫效力。
　　 2 H9N2亚型禽流感灭活疫苗(F株)的实验室免疫效力评价
　　 本研究以灭活疫苗(F株)接种SPF鸡,通过检测其抗体消长规律,发现疫苗接种2周后,产生的HI抗体效价在6 log2以上,且持续时间长达15周。
　　 3周龄SPF鸡接种灭活疫苗21d后,产生的HI抗体平均效价在9 log2以上,对9个分离株及F株攻毒后的喉头和泄殖腔排毒产生明显的抑制作用,所有试验鸡在攻毒后均未出现死亡。其中,L9株、F9株、S9株、D9株、M株和F株攻毒后5 d内均未检出排毒;F119株、W9株、YD株和D119株攻毒后5 d时,排毒率仅为1/10;而未接种疫苗的对照组攻毒后5 d排毒率均为10/10。攻毒后7d,所有免疫组都停止排毒。
　　 1日龄商品黄羽肉鸡经14日龄和21日龄两次灭活疫苗接种后,30、40、50、60日龄时的HI抗体效价平均为7.2 log2、8.1 log2、8.4 log2和8.2 log2。30日龄用F119株攻毒后,免疫接种组和攻毒对照组鸡均未发生死亡,也未出现明显的临床症状。在35日龄时检测发现,免疫接种鸡的呼吸道和泄殖腔排毒比例明显低于攻毒对照组。60日龄时,所有各组试验鸡的平均体重无显著差别。
　　 研究表明,虽然H9亚型AIV流行毒株发生了一定变异,但是现有疫苗仍能提供有效保护。
　　 3某鸡场发生H9N2亚型禽流感的原因分析
　　 本研究对某个H9N2亚型AI发病鸡场进行调查,分析H9N2亚型AI免疫程序,检测免疫抑制病和细菌性疾病的感染情况,以查明H9N2亚型AI的发生原因。
　　 调查发现,该鸡场J亚群白血病病毒(ALV-J)和网状内皮增生症病毒(REV)的抗原阳性检出率分别为3.94％和12.60％,而血清抗体的阳性检测率分别为1.1％～7.8％和6.7％～38.9％,表明鸡群已存在免疫抑制病的感染。鸡群中免疫抑制病的存在是导致鸡群免疫失败的重要原因。
　　 从该鸡场共分离得到41株大肠杆菌,血清型鉴定结果表明,优势血清型为O2、O78和01,占定型菌株的90.00％。药敏试验表明分离菌株对常用药物敏感性较低。低致病力禽流感病毒常与大肠杆菌形成混合感染,也是导致鸡群免疫失败和低致病力禽流感发生的重要因素。
　　 从鸡群240日龄抗体检测的结果看,H9亚型AIV的HI抗体水平明显低于H5亚型AIV和NDV。该鸡场虽然在14日龄和45日龄对鸡群进行过两次H9亚型禽流感疫苗的接种,但并不能保证产蛋期一直维持较高的抗体水平。