ETEC K88ab/K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及LT提升细菌黏附性能的初步研究

摘要

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coil，ETEC)是导致断奶前仔猪腹泻和死亡的主要病原之一。该病原菌含有两种致病因子：菌毛粘附素和肠毒素。菌毛粘附素与上皮细胞微绒毛的相互作用使ETEC能定殖于仔猪小肠。首次从腹泻仔猪分离鉴定的ETEC菌毛粘附素为K88菌毛。大多数从腹泻仔猪分离到的ETEC菌株表达有K88、K99、987P或F41菌毛粘附素；其中，K88是最流行的菌毛粘附素。近期的研究认为，细菌表达热敏肠毒素LT的功能除了导致宿主腹泻外，对小肠上皮细胞的细菌黏附具有促进作用。因此，本研究将集中如下两部分：一、克隆、表达ETEC K88ab/K88ad菌毛基因，并比较K88菌毛三种血清型的野生菌和重组菌对猪小肠上皮细胞的黏附差异；二、克隆、表达LT毒素基因，并探索LT毒素的表达对小肠上皮细胞的细菌黏附性能的影响。上述研究旨在为深入全面地研究ETEC的毒力因子奠定基础。试验分如下两部分：
　　 研究一：利用PCR技术，以产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88ab标准株C83901和K88ad标准株C83903基因组DNA为模板扩增出编码K88菌毛操纵子fae基因，大小约7.9Kb。将其克隆入表达质粒载体pBR322，经限制性内切酶消化、琼脂糖电泳鉴定，构建和筛选出含正确插入fae操纵子基因的pBR-K88ab和pBR-K88ad重组质粒。进一步将上述重组质粒DNA转化入不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000株。该重组菌可分别和鼠抗重组k88菌毛多抗血清和鼠抗K88菌毛单克隆抗体产生凝集反应，在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88菌毛。用热抽提法提取其体外表达的K88ab和K88ad菌毛，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色主要结构单位菌毛呈单一分子量约为26KDa蛋白条带。玻板凝集试验和Western blot结果表明：体外表达的K88ab、K88ad菌毛和野生型K88菌毛具有同样的免疫原性和反应原性。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型进行黏附试验和粘附抑制试验，结果表明：表达K88菌毛三种血清型的野生型标准株和重组菌株均能很好的黏附于IPEC-J2上皮细胞，而且鼠抗重组K88菌毛血清能有效抑制上述重组菌或野生菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。
　　 研究二：利用PCR技术，以K88ac标准株C83902基因组DNA为模板扩增出热敏肠毒素LT基因，大小约1.1Kb。将其克隆入表达质粒载体pACYC184，经限制性内切酶消化、琼脂糖电泳鉴定，构建和筛选出含正确插入LT基因的pACYC-LT重组质粒。利用类似的方法，构建和筛选出两种含点突变LT基因的重组质粒(pACYC-LT72和pACYC-LT192)。进一步将上述重组质粒DINA转化入不表达任何毒素的大肠杆菌SE5000株。GM1-ELISA结果表明，上述重组菌均能在体外正常表达LT毒素蛋白。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型，比较了表达和不表达LT基因的细菌对细胞的黏附性能。试验数据表明，LT的表达使细菌对肠上皮细胞的黏附效应明显增加(12.3±3.4倍)。LT毒素蛋白的两个单氨基酸突变体的表达，证明了LT毒素的ADP核糖基化作用对其增强致病菌对肠细胞的黏附作用是必要的。蛋白激酶A的抑制剂Rp-cAMP、腺苷酸环化酶的抑制剂DDA和LT毒素的受体GM1都可阻断LT毒素对细菌黏附性能的提升作用。