灰葡萄孢角质酶的致病作用及角质酶突变菌株的基因分析

摘要

灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)是重要的植物病原真菌，其产生的降解酶类是主要的致病因子。角质酶是病菌产生的能够降解植物体表角质层的水解酶。明确角质酶的致病作用，能够为进一步解析病菌致病机理提供依据。
　　 用紫外线诱变灰葡萄孢H2菌株，得到两株产角质酶能力增强的突变菌株H2-M1、H2-M2，其菌丝分泌的酶活性分别达34.68U/mL，33.51U/mL，分别为出发菌株的2.05倍和1.98倍；两株产酶能力降低的菌株H2-M3，H2-M4，酶活性为3.80 U/mL，3.98U/mL，分别占出发菌株的22.5％与23.5％。出发菌株菌丝产生的角质酶活性为16.92 U/mL。病菌萌发过程中芽管也能分泌角质酶，与菌丝相比酶活性较低。H2-M1、H2-M2、H2-M3和H2-M4分生孢子萌发时的角质酶活性分别为0.20U/mL、0.18U/mL、0.01U/mL和0.01U/mL，出发菌株酶活性为0.10U/mL。对突变菌株致病因子检测结果表明，4株突变菌株除产角质酶的性状发生了变异外，其它致病因子(果胶酶、纤维素酶、毒素)的代谢与出发菌株均没有显著差异。
　　 利用上述5个菌株的分生孢子悬浮液对番茄叶片喷雾接种，菌饼对果实接种，检测其致病性。结果表明，产酶能力强的两个突变菌株H2-M1、H2-M2，其致病力明显高于出发菌株，而酶活性低的H2-M3、H2-M4则显著低于出发菌株。对草莓果实和叶片的致病力检测结果与对番茄的检测结果一致，产生角质酶较少的突变株，其致病力显著低于出发菌株。从以上试验内容可以看出，灰葡萄孢角质酶在病菌侵入过程中能起促进病菌侵入、增加病菌毒力的作用。
　　 通过PCR技术，克隆获得突变菌株的角质酶基因，与出发菌株比较，虽然有少数碱基的差异，但是突变位点不在酶活性中心部位，也不在与底物结合部位；内含子中也有少数位点碱基发生变化，但编码的蛋白质与出发菌株一样。因此突变菌株的角质酶基因与出发菌株相比基本一致。实时荧光定量PCR(Real-timeqPCR)研究表明，角质酶基因在突变菌株中都能表达，但是H2-M1和H2-M2表达量高于出发菌株2倍以上，而H2-M3和H2-M4的表达量显著低于出发菌株，分别只有出发菌株的21％和19％。因此突变菌株的角质酶基因并未发生变异，产酶性状的变异可能是由基因转录改变造成的。