肠炎沙门氏菌生物被膜形成相关基因鉴定、缺失株构建及生物学特性研究

摘要

禽沙门氏菌病是指沙门氏菌属细菌引起的禽类急性或慢性疾病的总称，临床上多表现为败血症和肠炎。我国的禽沙门氏病比较复杂，鸡白痢、鸡伤寒和禽副伤寒三种疾病并存，它不仅是养禽业各个时期的经济问题，而且也是家禽及其产品进出口贸易的障碍。沙门氏菌可形成生物被膜，而细菌处于生物被膜状态可增强细菌对不利条件如干燥、极端的温度、抗菌素和消毒剂的抵抗力。这不仅使得沙门氏菌在家禽饲养环境和体内长期存活而不易被消灭，导致家禽的感染和蛋、肉的污染，而且以生物被膜形式存在的细菌在肉食品加工过程中不能被正常的清洗程序所去除，这也是造成人的食源性沙门氏菌病发生的重要原因。本研究主要通过转座子随机插入法鉴定获得肠炎沙门氏菌生物被膜形成相关基因，以自杀性载体构建插入缺失突变株，初步探索了生物被膜与致病性的关系，为阐明生物被膜在肠炎沙门氏菌中的致病作用以及研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础。
　　 1.转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物被膜形成相关基因
　　 利用结晶紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌进行生物被膜测定，结果表明所试84％的鸡源沙门氏菌菌株可形成生物被膜。选择生物被膜生长形成能力强的肠炎沙门氏菌CMCC50041，采用转座子随机插入法构建突变株库，共获得1924个突变株;筛选获得的生物被膜形成能力降低的突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及southernblot分析鉴定出15个插入基因，它们分别为metE、ompR、rpoS、rfaG、rfaJ、rfar、rfaP、rfbH、rhlE、spiA、steB、tpx、ybdN和2个未知功能的基因。其中，12个基因是影响生物被膜形成新鉴定的基因，这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物被膜形成的调控机制奠定了基础。
　　 2.肠炎沙门氏菌ompR基因缺失株的构建以及生物学特性的测定
　　 以肠炎沙门氏菌作为母本，运用自杀性载体pGMB151构建了ompR基因，经RT-PCR和蛋白表达检测证明了ompR基因缺失株构建成功;应用结晶紫染色法和扫描电镜观察法测定了缺失株的生物被膜形成能力，结果表明ompR基因缺失后不形成生物被膜;经荧光增白剂培养基培养以及卷毛蛋白的测定，进一步证明缺失株不表达卷曲菌毛和纤维素;因此ompR基因是通过降低卷曲菌毛和纤维素的表达来调控肠炎沙门氏菌生物被膜的形成。
　　 3.肠炎沙门氏菌spiA缺失株的构建以及生物学特性的测定
　　 以肠炎沙门氏菌作为母本，运用自杀性载体pGMB151构建了spiA基因缺失株，同样经RT-PCR和蛋白表达检测证明了spiA基因缺失株构建成功;应用结晶紫染色法和扫描电镜观察法测定了缺失株的生物被膜形成能力，结果表明spiA基因缺失后生物被膜形成受抑制;经荧光增白剂培养基培养以及卷毛蛋白的测定显示该缺失株仍表达纤维素，但是卷曲菌毛表达显著降低;因此spiA基因是通过降低卷曲菌毛来调控肠炎沙门氏菌生物被膜的形成。
　　 4.肠炎沙门氏菌ompR-spiA双缺失株的构建以及生物学特性的测定
　　 以肠炎沙门氏菌作为母本，运用自杀性载体pGMB151构建了ompR和spiA基因双缺失株，通过RT-PCR和蛋白表达检测证明了ompR/spiA双基因缺失株构建成功;ompR/spiA双缺失株的生长速度与spiA单缺失株类似，略低于野生株，其生物膜形成能力与ompR单缺失株一样，不形成生物被膜;经荧光增白剂培养基培养以及卷曲菌毛蛋白的测定，进一步证明双缺失株不表达卷曲菌毛蛋白和纤维素。因此ompR/spiA双缺失株的构建为肠炎沙门氏菌毒力的进一步研究奠定了基础。
　　 5.肠炎沙门氏菌生物被膜形成相关基因不同缺失株的毒力测定
　　 选择野生株和ompR、spiA、ompR-spiA缺失株进行上皮细胞的黏附和侵入试验以及巨噬细胞内增殖试验，结果显示各缺失株与野生株在上皮细胞内具有相同的黏附和侵入率;但在巨噬细胞内处于生物被膜状态缺失株增殖显著降低;随后进行BALB/c小鼠腹腔攻毒试验测定其毒力变化，结果表明在生物膜状态下，spiA基因缺失株以及野生株的半数致死量为107.47和10-0.03;处于浮游状态下，spiA基因缺失株以及野生株的半数致死量为107.13和100.13，ompR、ompR-spiA缺失株半数致死量为106.67CFU、107.13CFU。与野生株相比，ompR、spiA、ompR-spiA缺失株的毒力显著下降。因此，ompR、spiA基因不仅影响生物膜的形成，而且与细菌毒力相关。
　　 6.小鼠免疫保护性实验
　　 将ompR、spiA、rpoS、ompR-spiA、ompR-rpoS缺失株通过口服方式接种6周龄的BALB/c小鼠进行毒力的测定，结果表明ompR、spiA、rpoS、ompR-spiA、ompR-rpoS缺失株的半数致死量(LD50)都大于109CFU，而野生株的LD50为105CFU。以108CFU口服接种BALB/c鼠，测定不同时间体内细菌分布及病理变化，结果显示野生株肝、脾、派尔氏结中的细菌数显著上升，并在一周内全部死亡(p＜0.05)。双缺失株接种后在肝内经过一段时间逐渐被清除，而在脾、派尔氏结第四周时仍可分离到一定的细菌;单缺失株在肝、脾、派尔氏结均可分离到细菌。病理组织切片显示野生株引起肝、脾的病变严重，各缺失株引起的病变比较轻微。血清抗体水平测定表明，各缺失株经口服后可使机体产生较高的IgG抗体，并大多数于3周达到高峰;各缺失株中仅spiA缺失株可诱导少量地血清IgA抗体，ompR-rpoS缺失株可诱导少量的黏膜IgA抗体。以100倍LD50野生株攻毒后ompR、spiA、rpoS、ompR/rpoS和ompR/spiA缺失株免疫保护率分别为62.5％、50％、50％、37.5％和50％，其中ompR缺失株可提供较好的免疫保护性。由于ompR缺失株既不形成生物膜，免疫后又可产生较好的免疫保护作用，因此，ompR缺失株可作为肠炎沙门氏菌减毒活疫苗候选株。