奶牛乳腺上皮细胞系的建立及生理功能鉴定

摘要

本试验采用组织块法分离培养奶牛乳腺上皮细胞，采用多种方法纯化细胞，且对纯化的上皮细胞形态学和生理功能进行鉴定，并以十六代细胞为材料，应用实时定量PCR检测奶牛乳腺上皮细胞在脂多糖刺激下，细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达，并研究了催乳激素和赖氨酸处理时乳蛋白合成和分泌功能，结果说明本试验培养的细胞具有正常的乳腺上皮细胞功能，为进一步研究建立具有正常功能的永生化奶牛乳腺上皮细胞系奠定基础。
　　 试验一用组织块培养法获得大量奶牛的原代乳腺上皮细胞，联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法可获得纯化的、活力旺盛的乳腺上皮细胞，且在体外可连续传代二十五代以上，但随着细胞超过二十五代以后增殖活力有所下降。应用荧光免疫组化、核型分析和β-酪蛋白表达检测了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征和乳蛋白表达，同时检测到细胞角蛋白18的表达，并鉴定为上皮细胞；此外，研究还发现在不添加催乳激素的情况下，检测到乳腺上皮细胞能够表达较低的β-酪蛋白，实现了奶牛乳腺上皮细胞系的建立。
　　 试验二初步筛选出脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞的适宜浓度，再以该浓度刺激细胞，通过RT-PCR法检测细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达，试验结果表明：脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞24h后，IL-6、IL-8表达量显著升高(P<0.05)；TNF-α在脂多糖刺激后4h表达量达最高(P<0.05)。研究表明，该细胞可作为研究奶牛乳房炎病理机制以及细胞免疫作用的模型。
　　 试验三催乳素、氢化可的松和胰岛素不同组合刺激奶牛乳腺上皮细胞，采用相对实时荧光定量法检测β-酪蛋白、α-乳白蛋白和乳铁蛋白的mRNA表达。结果表明：在三种激素均添加的情况下，三种蛋白表达量最高(P<0.05)；而在不同组合的基础上添加赖氨酸，三种蛋白表达量有上升的趋势，但变化不明显。此外，采用ELISA法在蛋白水平上进行验证，结果与mRNA表达水平一致。说明本实验所获得的奶牛乳腺上皮细胞系并未发生转化，具有正常的生理功能。