单宁对高原鼠兔肝脏细胞色素P450酶含量及其mRNA表达的影响

摘要

青藏高原高寒生态系统中的多种植物均含有较高水平的酚类次生化合物，且酚类化合物水平因季节而不同。包括单宁在内的许多酚类次生化合物对动物的行为生理有一定的影响。动物体内的异源代谢酶能减缓植物多酚对动物的有害作用。细胞色素P450酶参与动物摄入体内的次生化合物的分解转化，而摄入的次生化合物又可能会影响这些酶基因的表达。高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)是分布于高寒草甸生态系统中的优势植食性小哺乳动物，终生取食含酚类水平较高的高原植物。本实验(一)不同季节从野外捕获高原鼠兔作为研究对象;(二)通过人工灌胃的方法，对高原鼠兔灌胃不同时间(1、4、8d)、不同剂量(0、10、20、40mg/kg.bw)的单宁酸，分别用RT-PCR的方法克隆高原鼠兔CYP1A2及CYP2E1基因的cDNA片段、荧光实时定量PCR方法测定其肝脏细胞色素酶CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达水平及Westernblot方法检测肝脏中这两种酶含量的变化，以研究高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1表达的季节性变化及单宁对两种酶表达的影响，探讨青藏高原植物和植食性动物间的协同进化。研究结果如下:
　　 1、通过RT-PCR的方法克隆获得的高原鼠兔CYP1A2和CYP2E1基因的部分cDNA序列，分别长921bp，编码307个氨基酸残基及长936bp，编码312个氨基酸残基。将这两个序列与已经公布的大鼠、小鼠、人的氨基酸序列进行相似性分析比对，结果显示:高原鼠兔肝脏CYP1A2与大鼠、小鼠、人的相似性分别为73.5％，72.5％及73.3％，CYP2E1与大鼠、小鼠、人的相似性分别为80.1％，80.8％及76％。
　　 2、野外生存环境下，不同月份高原鼠兔肝脏微粒体的CYP1A2和CYP2E1表达有明显的不同。
　　 5月份至8月份，高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1mRNA表达量呈现先上升后下降的趋势，两者均在6月份达到最高。Westernblot实验结果也表明，肝脏CYP1A2及CYP2E1酶含量同样呈现先上升后下降的趋势，两者均在6月份达到最高。
　　 3、单宁酸对高原鼠兔肝脏微粒体CYP1A2及CYP2E1的表达的影响因剂量及处理时间而不同。
　　 中、低剂量的单宁酸短时间处理促进高原鼠兔CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达，中、低剂量的单宁酸长时间处理及高剂量的单宁酸处理抑制高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达。即单宁酸浓度越高，处理时间越长，CYP1A2及CYP2E1mRNA的表达量越低。
　　 但Westernblot实验结果显示，所有的单宁酸处理组，高原鼠兔肝脏CYP1A2及CYP2E1酶的含量均显著降低。
　　 以上结果表明，单宁影响高原鼠兔肝脏细胞色素CYP1A2及CYP2E1基因的表达。在野外生存环境下，单宁对两种基因在转录和翻译水平的表达是一致的，逐月增加的单宁在低水平时促进两种基因的表达，高水平时抑制两种基因的表达。但是在人工灌胃条件下，单宁酸在转录和翻译水平对两种基因表达的影响有所不同。

目录

摘要

中英文对照

1 文献综述

1．1 高原鼠兔简介

1．2 植物单宁

1．2．1 植物的次生代谢

1．2．2 青藏高原气候及其特殊植被结构

1．2．3 单宁及其作用

1．3 植食性动物与植物的协同进化

1．3．1 动植物协同进化

1．3．2 植物对植食性动物的化学防御

1．3．3 植食性动物对次生化合物的应对策略

1．4 细胞色素P450酶及其研究现状

2 本论文的研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 实验仪器

3．2 主要试剂

3．3 主要试剂配制

3．4 实验方法

3．4．1 实验动物

3．4．2 高原鼠兔肝脏细胞色素P450基因cDNA片段的克隆

3．4．3 实时荧光定量PCR检测基因的mRNA表达水平

3．4．4 Western blot检测高原鼠兔肝脏CYP450酶含量的变化

4 结果

4．1 高原鼠兔肝脏P450基因cDNA片段的克隆

4．1．1 高原鼠兔CYP1A2 cDNA片段的PCR扩增结果及测序结果

4．1．2 高原鼠兔肝脏CYP2E1 cDNA片段PCR扩增结果及测序结果

4．1．3 高原鼠兔与其他物种的CYP1A2氨基酸序列比对结果

4．1．4 高原鼠兔与其他物种的CYP2E1氨基酸序列比对结果

4．2 高原鼠兔肝脏P450基因mRNA表达量的变化

4．2．1 高原鼠兔肝脏总RNA的抽提

4．2．2 高原鼠兔肝脏总RNA反转录

4．2．3 实时荧光定量PCR引物的鉴定

4．2．4 不同月份高原鼠兔肝脏CYP1A2 mRNA表达量的变化

4．2．5 不同剂量单宁酸对高原鼠兔肝脏CYP1A2 mRNA表达的影响

4．2．6 不同月份高原鼠兔肝脏CYP2E1 mRNA表达的变化

4．2．7 不同剂量单宁酸对高原鼠兔肝脏CYP2E1mRNA表达的影响

4．3 高原鼠兔肝脏CYP450酶含量的变化

4．3．1 不同月份高原鼠兔肝脏CYP1A2酶含量的变化

4．3．2 不同剂量单宁酸对高原鼠兔肝脏CYP1A2酶含量的影响

4．3．3 不同月份高原鼠兔肝脏CYP2E1酶含量

4．3．4 不同剂量单宁酸对高原鼠兔肝脏CYP2E1酶含量的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表和参加课题情况

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