精氨酸对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响及其调控机制

摘要

该研究以体外培养的中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞(CCMEC)为试验模型，研究培养基中不同水平精氨酸(Arg)对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响，在此基础上，进一步研究Arg影响酪蛋白合成的机制，分别从细胞增殖水平，乳酪蛋白基因、酪蛋白合成信号转导相关基因mRNA转录水平等方面来进行初步探讨。旨在得出Arg影响乳酪蛋白合成的一般规律，筛选出酪蛋白最大合成量时Arg的浓度;揭示Arg影响酪蛋白合成的细胞分子机制，以为提高牛奶中乳蛋白含量、改善牛奶质量提供理论依据。研究包括四个部分:试验一奶牛乳腺上皮细胞的体外培养
　　 该试验以健康的中国荷斯坦奶牛的泌乳期乳腺组织为试验材料，采用胶原酶消化法在体外培养得到奶牛乳腺上皮细胞，根据成纤维细胞和乳腺上皮对胰蛋白酶的敏感性不同进行奶牛乳腺上皮细胞的纯化，对分离纯化的细胞进行传代、冻存与复苏。并对得到的细胞进行形态学、生长特性、免疫组织化学、生物学功能的鉴定。利用台盼蓝计数法绘制细胞生长曲线，采用免疫组化法对上皮细胞特异性蛋白CK-18的表达进行鉴定，采用RT-PCR技术对乳腺上皮细胞内编码酪蛋白合成的基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3的表达进行检测。结果显示:分离得到的细胞呈鹅路石样，细胞之间连接紧密且界限清晰，单层生长;细胞生长曲线呈S形，具有明显的潜伏期、指数生长期、平台期，细胞于第三天进入指数生长期于第七天进入平台期，符合一般的细胞生长规律;CK-18的免疫组化鉴定结果呈现出强阳性，说明分离得到的细胞属典型的上皮细胞;RT-PCR结果显示，CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3基因在细胞内均能有效的表达，说明分离得到的细胞具有乳腺上皮细胞的特异性生物功能。
　　 试验二精氨酸对乳腺上皮细胞内酪蛋白合成的影响
　　 该试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为试验模型，研究培养基中不同水平的Arg对奶牛乳腺上皮细胞内αS、β-酪蛋白合成的影响。试验采用单因素7水平完全随机试验设计，以无Arg的培养基即Arg0倍组(0.00mg/L)为对照，Arg0.25倍组(69.500mg/L)、0.5倍组(139.00mg/L)、1倍组(278.00mg/L)、2倍组(556.00mg/L)、4倍组(1112.00mg/L)、8倍组(2224.00mg/L)为试验处理组，采用ELISA双抗夹心法对各个组的细胞内αS、β-酪蛋白合成量进行测定。结果显示:对于αS-酪蛋白，除了Arg0.25倍组与Arg8倍组，各处理组与对照组相比差异显著(P＜0.05)，且在Arg2倍组时αs-酪蛋白的合成量达到最大;对于β-酪蛋白，除了Arg0.25倍组，各个处理组与对照组相比差异显著(P＜0.05)，且在Arg2倍组时β-酪蛋白的合成量达到最大。
　　 试验三精氨酸对乳腺上皮细胞生长及增殖的影响
　　 该试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究培养基中不同水平的Arg对奶牛乳腺上皮细胞生长以及细胞增殖活性的影响。试验设计同试验二。采用台盼蓝计数法绘制不同处理组的细胞生长曲线，采用噻唑蓝(MTT)法分别检测各个处理组的24h、48h、72h的细胞增殖活性。结果显示，各个处理组的细胞生长曲线均呈S形，在第三天达到指数期，第七天进入平台期，进入平台期后Arg2倍组的细胞数目高于其他各组;MTT结果显示，24h时，Arg0.25-4倍组与对照组相比均差异显著(P＜0.05);48h、72h时，Arg各组与对照组相比均差异显著(P＜0.05)。说明精氨酸能促进乳腺上皮细胞的增殖，且在Arg浓度为69.50-1112.00mg/L（0.25倍组-4倍组）时促增殖效果较佳。
　　 试验四精氨酸对乳腺上皮细胞内酪蛋白合成以及信号转导相关基因表达的影响
　　 该试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究培养基中不同水平的Arg对奶牛乳腺上皮细胞内编码乳酪蛋白合成的基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3以及与乳蛋白合成有关的JAK2/STAT5、mTOR信号通路上相关基因JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBP1的表达的影响。试验设计同试验二。以GAPDH为内参，采用Real-TimePCR技术检测各个处理组的CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBP1基因的相对表达量。结果显示:对于CSN1S2、CSN2、JAK2基因，除了Arg0.25倍组与Arg8倍组外，其他各处理组与对照组相比显著上调其表达(P＜0.05)，对于STAT5、mTOR基因，除了Arg8倍组外，各处理组与对照组相比显著上调其表达(P＜0.05)，对于S6K基因，除了Arg0.5倍组外，其他各各处理组与对照组相比显著上调其表达(P＜0.05)，对于4EBP1基因，除了Arg0.25倍组外，其他各各处理组与对照组相比显著下调其表达(P＜0.05);在Arg2倍组时，CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、S6K基因的相对表达达到最大且与其他各组差异显著(P＜0.05)，而4EBP1基因的相对表达量最低且与其他各组差异显著(P＜0.05)。结果说明，Arg对编码乳蛋白合成基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3的表达起着重要的促进作用，适宜浓度的Arg能够促进奶牛乳腺上皮细胞中CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3基因的表达，且当体外细胞培养液中Arg浓度为556mg/L时，这四种酪蛋白基因的表达显著上调;Arg能够激活细胞内的JAK2/STAT5、mTOR通路从而促进乳蛋白基因的表达，当体外细胞培养液中Arg浓度为556mg/L时，JAK2、STAT5、mTOR、S6K基因的表达均上调，而4EBP1基因表达显著下调。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 研究的目的和意义

1．2 国内外研究进展

1．2．1 精氨酸营养概述

1．2．2 乳腺内乳蛋白的合成及氨基酸代谢

1．2．3 氨基酸对乳蛋白合成的调控

1．2．5 奶牛乳腺上皮细胞体外培养及其应用

1．3 研究内容

1．3．1 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

1．3．2 精氨酸对酪蛋白合成的影响

1．3．3 精氨酸对乳腺上皮细胞生长的影响

1．3．4 精氨酸对乳腺上皮细胞内酪蛋白合成以及信号转导相关基因表达的影响

1．4 技术路线

第二章 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

2．1 试验材料

2．1．1 仪器设备

2．1．2 主要试剂

2．2 试验方法

2．2．1 乳腺组织的采集

2．2．2 乳腺上皮细胞的分离培养

2．2．3 乳腺上皮细胞的冻存

2．2．4 乳腺上皮细胞的复苏

2．2．5 乳腺上皮细胞生长曲线的绘制

2．2．5 乳腺上皮细胞的免疫组织化学鉴定

2．2．6 乳腺上皮细胞的分子生物学鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及形态学观察

2．3．2 奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线的绘制

2．3．3 奶牛乳腺上皮细胞的免疫组化鉴定

2．3．4 奶牛乳腺上皮细胞的分子生物学鉴定

2．4 讨论

2．4．1 乳腺上皮细胞形态学观察

2．4．2 乳腺上皮细胞的生长特征

2．4．3 乳腺上皮细胞的免疫组化鉴定

2．4．4 乳腺上皮细胞的分子生物学鉴定

2．5 小结

第三章 精氨酸对乳腺上皮细胞内酪蛋白合成的影响

3．1 试验材料

3．1．2 仪器设备

3．1．3 主要试剂

3．2 试验方法

3．2．1 无精氨酸的DMEM/F12培养基的配制

3．2．2 试验设计

3．2．3 乳腺上皮细胞总蛋白的提取

3．2．4 乳腺上皮细胞内αs-、β-酪蛋白合成量的测定

3．2．5 统计学分析

3．3 结果与分析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 精氨酸对乳腺上皮细胞生长及增殖的影响

4．1 试验材料

4．1．1 仪器设备

4．1．2 主要试剂

4．2 试验方法

4．2．1 试验设计

4．2．2 台盼蓝染色计数法绘制细胞生长曲线

4．2．3 MTT法检测细胞增殖

4．2．4 统计学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 不同精氨酸处理组的细胞生长情况

4．3．2 不同Arg水平对乳腺上皮细胞增殖活性的影响

4．4 讨论

4．4．1 不同精氨酸处理组的细胞生长情况

4．4．2 不同Arg水平对乳腺上皮细胞增殖活性的影响

4．5 小结

第五章 精氨酸对乳腺上皮细胞内酪蛋白合成以及信号转导相关基因表达的影响

5．1 试验材料

5．1．1 仪器设备

5．1．2 主要试剂

5．2 试验方法

5．2．1 试验设计

5．2．2 细胞总RNA的提取

5．2．3 反转录反应

5．2．4 Real-Time PCR反应

5．3 统计学分析

5．4 结果与分析

5．4．1 各基因的Real-Time PCR的标准曲线、扩增曲线与熔解曲线

5．4．1 Arg对编码乳蛋白合成相关基因表达的影响

5．4．2 Arg对乳腺细胞中信号转导相关基因表达的影响

5．5 讨论

5．5．1 Arg对编码乳蛋白合成相关基因表达的影响

5．5．2 Arg对乳腺细胞中信号转导相关基因表达的影响

5．6 小结

第六章 全文总体讨论与结论

6．1 全文讨论

6．2 全文结论

6．3 研究的创新点

6．4 有待进一步研究的问题

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

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