基于PCR方法布鲁菌疫苗株与野生菌株鉴别诊断方法的建立

摘要

布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella)引起的一种重要人畜共患传染病，给畜牧业和人类健康造成严重危害。布鲁菌广泛分布于世界各地，主要分为7个种，包括牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、羊种布鲁菌、沙林鼠种布鲁菌、绵羊附睾种布鲁菌、犬种布鲁菌和海洋哺乳动物种布鲁菌。弱毒疫苗免疫是布鲁菌病防控的主要技术措施之一。目前，国外使用的弱毒疫苗主要是牛种布鲁菌S19和RB51、羊种布鲁菌Rev.1，国内为牛种布鲁菌BA19、羊种布鲁菌M5、猪种布鲁菌S2、人布鲁菌104M。尽管这些疫苗菌株的致病性已高度弱化，但仍具备对人和其它动物的感染性及一定的致病力。常规血清学方法不能严格区分弱毒疫苗免疫和野生菌株感染，因此弱毒疫苗免疫对布鲁菌病流行病学监测和临床诊断带来一些困扰。基于准确进行布鲁菌病诊断、流行病学监测以及公共卫生安全的考虑，建立可准确区别布鲁菌弱毒疫苗与野生菌株的检测方法具有重大的现实意义。本研究根据不同布鲁菌疫苗基因特性，分别建立了能够快速鉴别猪种布鲁菌疫苗株S2的双重PCR检测方法、牛种布鲁菌疫苗株BA19Cycling探针Real-timePCR检测方法、羊种布鲁菌疫苗株M5MGB探针Real-timePCR检测方法，从而填补国内有关这3个疫苗分子检测技术的空白，为布鲁菌病的诊断、流行病学监测以及布鲁菌疫苗的推广应用提供了技术保障，具有良好的应用前景。
　　 1.猪种布鲁菌疫苗株S2双重PCR诊断方法的建立
　　 根据NCBI上发表的猪种布鲁菌疫苗株S2基因序列，经比对发现，在其IclR基因上存在25bp序列缺失，以该特征性缺失片段设计特异性引物，并结合布鲁菌经典检测方法AMOS中猪种1型特异性引物，建立了双重PCR检测方法。该双重PCR方法的判定标准为:同时出现500bp和285bp两条带判为疫苗株S2阳性，即疫苗株S2;其它均判为疫苗株S2阴性，即非疫苗株S2;若出现285bp单一条带判为猪种布鲁菌1型菌株。特异性试验结果显示:仅疫苗株S2检测为阳性;而18个布鲁菌种型的标准参考株、4株布鲁菌疫苗株BA19、S19、M5、104M和4株非布鲁菌菌株基因组DNA进行PCR扩增，结果均为阴性，即非疫苗株S2。灵敏性试验显示，该双重PCR方法对疫苗株S2基因组DNA的最低检出限约为30fg，相当于能检测到9个细菌。用该双重PCR方法对中国兽医药品监察所保存的58株布鲁菌分离株基因组DNA进行检测，结果显示，全部菌株经检测均未同时出现两条特异条带，即非疫苗株S2;但是12个样本为猪种1型菌株。对本室近年来采集的145份牛血清样本、20份奶样本基因组DNA进行检测，结果显示，全部样本检测均未同时出现两条特异条带，即非疫苗株S2;但有11份样本为猪种1型菌株阳性。上述试验证明，建立的猪种布鲁菌疫苗株S2分子诊断方法敏感特异、快速准确，可用于猪种布鲁菌疫苗株S2与野生菌株的快速鉴别检测。
　　 2.牛种布鲁菌疫苗株BA19及S19Cycling探针Real-timePCR检测方法的建立
　　 目前，我国使用牛种布鲁菌疫苗株BA19，由于BA19与S19为同源菌株，利用该特点，根据Whatmore验证的牛种布鲁菌疫苗株S19上ClpX基因的SNP位点设计引物和Cycling探针，建立Real-timePCR方法。该Real-timePCR方法的判定标准为:在35循环内出现扩增曲线，且在40循环时RFU值大于0.10，判定为出现典型扩增曲线，结果为布鲁菌阳性;当使用FAM标记ClpX-P1探针检测时，出现典型扩增曲线判为疫苗株BA19（或S19）阳性，即为疫苗株BA19或S19;出现HEX标记ClpX-P2探针的典型扩增曲线判为非疫苗株BA19（或S19）的其它布鲁菌阳性，即为非BA19（或S19）的其它布鲁菌株;无任何曲线扩增时，结果为阴性，即无布鲁菌。特异性试验结果显示:疫苗株BA19和S19按本方法检测，可鉴定为疫苗株BA19或S19阳性;18个布鲁菌种型的标准参考株、3株布鲁菌疫苗株S2、M5、104M，按本方法鉴定为非BA19（或S19）的其它布鲁菌株阳性，CT值集中在11.21-25.62之间;4株非布鲁菌菌株结果为阴性，表明该方法特异性良好。以疫苗株BA19基因组DNA做10倍递进稀释，进行灵敏性试验，结果该方法的最低检出限约为60fg基因组DNA，相当于能检测到18个细菌。选择10-3～10-5三个稀释度分别进行重复性试验，结果显示三个稀释度CT值的变异系数均小于1％，表明本方法重复性良好。对中国兽医药品监察所保存提供的58株布鲁菌分离株进行Real-timePCR检测，结果显示，全部样本均鉴定为非疫苗株BA19（或S19）的其它布鲁菌。对近年来从我国部分布鲁菌病疫区牛群中采集的临床血清样本125份，用Real-timePCR方法检测。结果显示，其中39份样本为疫苗株BA19（或S19）阳性，81份样本为非疫苗株BA19（或S19）的其它布鲁菌;5个样本无任何扩增曲线出现，结果为阴性。来自另5个牛场且未进行过布鲁菌疫苗免疫的20份血清样本和20份奶样本检测结果均为非疫苗株BA19（或S19）的其它布鲁菌。上述试验证明，建立的BA19及S19疫苗株Cycling探针Real-timePCR检测方法，具备了检测速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，可用于我国牛种布鲁菌疫苗BA19免疫与野生菌株感染的鉴别检测。
　　 3.羊种布鲁菌疫苗株M5以及母源株M28MGB探针Real-timePCR检测方法的建立
　　 根据NCBI上发表的羊种布鲁菌疫苗株M5（母源株M28）基因组序列，经比对，选择glycosyltransferase基因上SNP位点设计引物和MGB探针，建立Real-timePCR方法。该Real-timePCR方法的判定标准为:在35循环内出现扩增曲线，且在40循环时RFU值大于0.03，判定为出现典型扩增曲线，结果为布鲁菌阳性;当使用VIC标记M5G探针检测时，出现典型扩增曲线判为疫苗株M5（或M28）阳性，即为疫苗株M5或母源株M28;当使用FAM标记M5A探针检测时，出现典型扩增曲线判为非疫苗株M5（或M28）其它布鲁菌株阳性，即为非疫苗株M5（或M28）的其它布鲁菌株;无任何曲线扩增时，结果为阴性，即无布鲁菌。特异性试验结果显示:疫苗株M5按本方法检测，结果为疫苗株M5阳性;18个布鲁菌种型的标准参考株、4株布鲁菌疫苗株S2、BA19、S19、104M，按本方法鉴定为非疫苗株M5（或M28）的其它布鲁菌株，CT值在13.03-28.06之间;4株非布鲁菌菌株结果为阴性，表明本方法特异性良好。以疫苗株M5基因组DNA做10倍递进稀释，进行灵敏性试验，结果显示本方法的最低检出限约为300fg基因组DNA，相当于能检测到90个细菌。选择10-1～10-3三个稀释度分别进行重复性试验，结果显示三个稀释度CT值的变异系数均小于1％，表明本方法重复性良好。对中国兽医药品监察所保存提供的58株布鲁菌分离株进行Real-timePCR检测，结果显示，其中4份可能为疫苗株M5或母源株M28;54份为非疫苗株M5（或M28）的其它布鲁菌。对近年来从我国部分布鲁菌病疫区牛群中采集的临床血清样本125份，用Real-timePCR方法检测。结果显示，其中15份样本为疫苗株M5或母源株M28;105份样本为非疫苗株M5（或M28）的其它布鲁菌;5个样本无任何扩增曲线出现，结果为阴性。来自另外5个牛场且未进行布鲁菌疫苗免疫的20份血清样本和20份奶样本检测结果均为非疫苗株M5（或M28）的其它布鲁菌。上述试验证明，该Real-timePCR方法，检测速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好，可用于羊种布鲁菌疫苗株M5（及母源株M28）与野生菌株感染的鉴别检测。

目录

摘要

符号说明

第一部分 文献综述

布鲁菌疫苗株检测技术研究进展

1．细菌学检测方法

2．免疫学检测方法

3．分子生物学方法

第二部分 研究内容

第一章 猪种布鲁菌疫苗株S2双重PCR诊断方法的建立

1 材料与方法

2 结果：

3 讨论

4 小结

第二章 牛种布鲁菌疫苗株BA19及S19 Cycling探针Real-time PCR检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三章 羊种布鲁菌疫苗株M5以及母源株M28 MGB探针Real-time PCR检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献：

附录一：

致谢

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