大肠杆菌毒力岛HPI相关基因缺失株的研究

摘要

耶尔森菌强毒力岛(highpathogenicityisland，HPI)是最早发现于耶尔森菌中的，大小从36kb到43kb，能够编码摄取铁载体耶尔森菌素(yersiniabactin，Ybt)的基因及其调节基因(irp1、irp2、fyuA)，与铁摄取与调节有关，是表达小鼠致死表型不可缺少的遗传单元;是决定该菌致病性和毒力的重要因素之一。我们已发现HPI存在于多种肠道杆菌中，如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌等，HPI可能是通过基因的水平转移在不同种属中分布。HPI不仅赋予病原体这样特殊的致病力，与感染过程有关，而且在细菌进化过程中同样扮演重要角色。为揭示HPI毒力岛对大肠杆菌毒力的影响，本文做了三个方面的研究:
　　 一是利用Red重组系统对2株HPI+菌的这四个基因的单基因缺失株分别进行基因敲回，筛选出敲回成功的菌株。irp1、irp2、fyuA、ybtA是HPI毒力岛的四个关键结构基因，与毒力岛的毒性有着密切的关系，本实验先合成出含有重组同源臂的这四个基因的部分PCR产物，利用Red重组原理30℃表达出诱导蛋白，将该PCR产物分别与单基因缺失株重组，从而实现基因的互换。筛选出重组成功的菌株，由于重组成功的细菌没有任何筛选标记，而未重组成功的细菌带有FRT片段标记的卡纳抗性，所以本实验利用平板大量点样的方法循序渐进的筛选出重组成功的菌株。
　　 二是比较S793103菌株4个单基因缺失株（△irp1、△irp2、△ybtA、△fyuA）与原始毒株的在铁缺陷型培养基NBD培养基中的生长趋势，来研究它的摄铁性变化。为了进一步研究猪源HPI+大肠杆菌毒力岛相关关键结构基因的铁蛋白调节功能，采用铁缺陷型培养基NBD培养原始野生毒株和基因缺失株，通过活菌计数从而来研究它们的生长特性，培养原始毒株与缺失株，采用NBD培养基连续培养监测10小时达到细菌生长稳定期，期间观察测量它们的吸光值OD600，绘制出生长趋势曲线图，比较基因敲除前后它们的摄铁功能变化情况。结果显示其生长速度受到了一定的影响，这表明HPI毒力岛与该菌的摄铁能力相关，并且这5株菌到达生长平台期的时间没有显著性差异，这提示该HPI+大肠杆菌可能还存在其他的摄铁系统。
　　 三是通过动物实验确定单基因缺失株和野生毒株对大肠杆菌毒力的影响，从而验证了这四个关键基因的相关作用，为进一步研究猪源HPI+大肠杆菌奠定了坚实的基础。对30日龄ICR小鼠进行分组，按浓度梯度分别利用这四个基因的原始野生毒株与缺失株接种小鼠，并设置阳性与阴性对照，接种后每隔12小时进行一次观察，连续观察7天，以改良寇氏法计算LD50，比较该基因敲除前后对其毒力的影响变化。对死亡小鼠进行剖检，记录肉眼病理变化，以及进行细菌分离和毒力基因的PCR鉴定。数据分析发现原始野生毒株与基因缺失株对小鼠的毒力有明显的区别，有菌毛的菌株致病性明显强于没有菌毛的菌株，这表明HPI毒力岛与大肠杆菌的毒力相关。

目录

论文说明

符号说明

综述

研究一 大肠杆菌毒力岛HPI相关基因缺失株的敲回

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

研究二 大肠杆菌毒力岛HPI相关基因缺失株的生长特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

研究三 大肠杆菌毒力岛HPI相关基因缺失株的毒力特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

总结

参考文献

致谢

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