EGCG对幼龄兔卵母细胞IVM的影响及BMP-15、FSHR基因在卵母细胞IVM中的表达

摘要

卵母细胞或胚胎在体外培养时得不到母体抗氧化剂的保护，产生的氧自由基会对卵母细胞的成熟及胚胎的发育产生抑制作用，这是制约卵母细胞体外培养效果的因素之一。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是天然的抗氧化剂，且无毒副作用，是体外培养体系的一种理想的抗氧化添加成分。本实验以新西兰白兔为动物模型，对其进行超数排卵处理后，采集COCs进行体外成熟培养。在TCM-199基础培养体系中通过添加不同浓度的EGCG（0μM、10μM、15μM、20μM和25μM）来研究其对新西兰兔卵母细胞体外成熟的影响，旨在改善兔的体外成熟培养体系，提高兔卵母细胞体外培养的效果。同时，采用实时荧光定量PCR技术，检测了幼龄兔卵母细胞成熟过程中BMP-15基因、FSHR基因的相对表达丰度，探讨了BMP-15基因、FSHR基因对卵母细胞体外成熟的影响，为进一步研究兔BMP-15基因、FSHR基因在生殖系统中所发挥的作用及其生殖生物学功能提供理论依据。本研究结果如下:
　　 1.在TCM-199基础培养体系中添加不同浓度的EGCG(0μM、10μM、15μM、20μM和25μM)，结果显示，随着EGCG添加浓度的升高，卵母细胞成熟率不断提高，当添加浓度为15μM和20μM时，其对卵母细胞的成熟有明显的促进作用，差异显著(P＜0.05);但当EGCG添加过量时，卵母细胞的成熟率显著降低。对于幼龄兔，添加15μM和20μM相比，效果差异不显著(P＞0.05);但是，对于成年兔，添加20μM要明显优于15μM，差异显著(P＜0.05)。
　　 2.幼龄兔卵母细胞体外成熟率总体上低于成年兔，差异不显著（P＞0.05）;当添加15μM、25μMEGCG时，幼龄兔卵母细胞体外成熟率却高于成年兔，但差异也不显著(P＞0.05)。
　　 3.通过实时荧光定量PCR检测发现，BMP-15基因、FSHR基因在幼龄兔卵母细胞成熟发育的不同阶段中有不同的表达量。对于BMP-15基因，在未成熟卵母细胞中表达水平较低，随着培养时间的推移，其表达量逐渐升高，在培养12h时出现表达量的峰值，并且此后一直维持较高的表达量，直至24h，随后下降。这与COCs成熟过程中卵丘细胞的扩散相一致，推测BMP-15基因对于卵丘细胞的扩散有重要作用。对于FSHR基因，在未成熟卵母细胞中有较高表达，0h、6h、有较高的表达量，随后逐渐下降;这可能与卵泡发育初期需要更多的FSH刺激有关，表明FSHR基因对于卵泡发育及卵母细胞的成熟具有重要作用。
　　 4.在幼龄兔卵母细胞成熟发育的全过程中，BMP-15基因、FSHR基因的相对表达量呈逆向的动态变化趋势，BMP-15能够抑制FSHR的表达，对FSHR具有负向调控作用。

目录

符号说明

第一章 文献综述

1．卵母细胞体外成熟

1．1 幼畜的超数排卵

1．2 卵母细胞体外成熟培养

1．3 卵母细胞成熟过程及调节机制

1．4 影响卵母细胞成熟的因素

2．EGCG及生物学作用

2．1 EGCG抗氧化作用

2．2 EGCG免疫调节作用

2．3 EGCG对动物生殖的作用

3．BMP-15、FSHR基因相关研究

3．1 BMP-15基因概述

3．2 BMP-15在组织中的表达

3．3 BMP-15的生物学作用

3．4 FSHR的结构

3．5 FSHR的转导机制

4．实时荧光定量PCR技术

4．1 实时荧光定量PCR技术的原理

4．2 实时荧光定量PCR的定量方法

4．3 实时荧光定量PCR的应用

4．4 影响实时荧光定量PCR结果的因素

5．本研究的目的意义

参考文献

第二章 EGCG对新西兰兔卵母细胞IVM的影响

1．试验材料

1．1 试验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要溶液配置

2．实验方法

2．1 实验分组

2．2 实验内容

2．3．超数排卵处理

2．4 卵母细胞的获取及选择标准

2．5 卵母细胞体外成熟培养

2．6 数据处理

3 结果与分析

3．1 不同浓度EGCG对幼龄兔卵母细胞成熟的影响

3．2 不同浓度EGCG对成年兔卵母细胞成熟的影响

3．3 添加相同浓度EGCG幼龄兔与成年兔卵母细胞成熟率的差异

4 讨论

4．1 幼龄兔与成年兔卵母细胞体外成熟的差异

4．2 EGCG在卵母细胞成熟培养中的作用

参考文献

第三章 BMP-1 5、FSHR基因在幼龄新西兰兔卵母细胞IVM中的表达

1．试验材料

1．1 试验动物

1．3 主要仪器

1．4 主要溶液配置

2 实验方法

2．1 不同成熟阶段卵母细胞选择标准

2．2 卵母细胞总RNA的提取

2．3 反转录——cDNA链的获得

2．4 BMP-15基因、FSHR基因、β-actin基因PCR扩增

2．5 目的片段的纯化回收

2．6 PCR产物与克隆载体的连接

2．7 质粒的转化

2．8 阳性克隆的PCR鉴定

2．9 序列测定

2．10 实时荧光定量PCR

2．11 统计分析

3 结果与分析

3．1 总RNA的检测

3．2 目的基因的扩增和阳性克隆的PCR鉴定

3．3 兔BMP-15基因、FSHR基因测序及比对

3．4 实时荧光定量PCR产物的特异性检测

3．5 基因扩增效率一致性的判定

3．6 BMP-15和FSHR基因在幼龄兔卵母细胞体外成熟过程中的相对表达变化

4 讨论

4．1 BMP-15对卵泡发育及卵母细胞成熟的调控

4．2 FSHR在卵泡卵母细胞成熟过程中的表达

4．3 BMP-15与FSHR的相互作用

参考文献

结论

致谢

攻读学位期间发表论文及获得专利情况

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