联苯菊酯降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

摘要

拟除虫菊酯是一类模拟天然除虫菊素的人工仿生化合物，是近年农用及卫生杀虫剂的主要支柱之一。目前，较为常用的拟除虫菊酯农药主要有氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和联苯菊酯。它们在结构上较为相似，只是取代基不同，这使得它们各自的半衰期有所不同，且生物转化的难易程度和毒性也有很大差异。研究表明，这类农药普遍具有难降解的特点，对哺乳动物具有免疫系统毒性、心血管毒性和遗传毒性，有些品种还会致癌、致畸、致突变。
　　 联苯菊酯是上世纪80年代初开发的一种新型杀虫剂，具有强大的胃毒和触杀作用，广泛应用于对棉花、蔬菜、果树、茶树等害虫的防治及白蚁、螨虫等家庭有害昆虫的防治。该化合物对光、热稳定，能附着作物表面不易被雨水冲刷，故残效期长，进入环境不易分解，因而带来了环境和食品安全问题。
　　 微生物作为生物修复中的主体，对农药残留的降解起着重要作用。人们对农药降解微生物的研究至今已取得了很大进展，表现在降解农药的微生物种类不断被发现，降解机理日趋深入，降解效果稳定提高等方面。目前国际上已分离出许多拟除虫菊酯类农药降解菌株，而且对菌株性质、生长条件进行了深入的研究。但国内外对拟除虫菊酯农药的降解研究主要集中在氯氰菊酯和溴氰菊酯等几种，对联苯菊酯的降解研究较少，且有的菌株降解能力较低或生长较慢，不利于大范围推广应用。本研究从扬州农药厂附近地表土壤中，分离获得一株联苯菊酯的高效降解菌，并对其进行了鉴定、降解特性和降解途径的研究，以期为环境中联苯菊酯的降解提供参考。实验的创新点及主要研究结果如下:
　　 1、筛选得到一株降解联苯菊酯的新型菌株。通过初筛和复筛，从长期受农药污染的土壤中分离得到一株高效的联苯菊酯降解菌S8，对100mg·L-1联苯菊酯5d的降解率达55.2％。经过形态观察、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析，鉴定为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，相似度为100％，该菌种对联苯菊酯的降解尚未见报道，为新型降解菌株。
　　 2、菌株以联苯菊酯为唯一碳源降解的验证。通过唯一碳源实验的证明，菌株S8不能仅利用丙酮、吐温20进行生长，因此在培养液体系中是以联苯菊酯为唯一碳源进行生长。
　　 3、菌株降解动力学分析。通过对菌株降解过程的分析，降解在第三天达平衡，经降解动力学分析，降解过程基本满足一级反应模型，R2=0.9713，降解速率常数为0.289d-1，半衰期为60.7h。
　　 4、菌株的降解特性研究。通过pH、温度、接种量、初始农药添加量的变化对菌株S8降解特性的研究发现，菌株在pH为6.0-8.0和温度30℃-35℃的范围内，可保持较高的降解特性，因而对pH和温度的耐受范围较大。而在接种量为5％，初始农药添加浓度50 mg·L-1降解率最高。
　　 5、菌株的降解产物分析。通过对降解产物的GC-MS图谱分析，联苯菊酯首先通过酯键断裂降解生成两个较小的羧酸和醇，三氟氯菊酸和2-甲基-3-苯基苯甲醇。而后进一步氧化、脱氢、开环，生成毒性更小或者无毒的化合物。
　　 6、菌株降解特性改良研究。通过高浓度再驯化、紫外诱变、饥饿诱导对菌株S8进行改良，改良后菌株的降解性能均有不同程度的提升。高浓度再次驯化改良，使菌株对联苯菊酯的降解率由原来的57.1％提高到71.9％;紫外诱变改良使菌株个体明显变大，Z10的降解率提高了33.5％，Z15提高了20.2％，Z20提高了36.3％;饥饿诱导改良1d的菌株对联苯菊酯的降解率提高了20.8％，但饥饿诱导3d和5d后菌株对联苯菊酯的降解率分别提高了4.4％和1.7％。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 农药的残留概况

1．1．1 农药的定义

1．1．2 农药残留及其危害

1．1．3 农药残留的治理方法

1．2 拟除虫菊酯类农药微生物降解的研究概况

1．2．1 拟除虫菊酯类农药简介

1．2．2 降解拟除虫菊酯农药的微生物

1．2．3 微生物降解的影响因素

1．2．4 拟除虫菊酯类农药的降解机理研究

1．2．5 拟除虫菊酯类农药微生物降解的研究趋势

1．2．6 拟除虫菊酯类农药微生物降解的研究展望

1．3 本研究的设计思路和研究目的

第二章 气相色谱测定联苯菊酯农药残留的方法

2．1 实验材料

2．1．1 药品与试剂

2．1．2 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 不同萃取剂对培养液中联苯菊酯的提取影响

2．2．2 GC-FID与GC-ECD对联苯菊酯的检测对比

2．2．3 培养液中联苯菊酯的回收率实验

2．2．4 高温灭菌对液体介质中联苯菊酯检测的影响

2．2．5 标准曲线的制作

2．3 结果与分析

2．3．1 不同萃取剂对培养液中联苯菊酯的提取影响

2．3．2 GC-FID与GC-ECD对联苯菊酯的检测对比

2．3．3 培养液中联苯菊酯的回收率实验

2．3．4 高温灭菌对液体介质中联苯菊酯检测的影响

2．3．5 标准曲线的制作

2．4 结论

第三章 联苯菊酯降解菌的分离筛选与鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 药品与试剂

3．1．2 培养基

3．1．3 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 联苯菊酯降解菌的分离纯化

3．2．2 菌株的筛选

3．2．3 菌株降解能力测定

3．2．4 菌株的鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 联苯菊酯降解菌的筛选

3．3．2 菌种的鉴定

3．4 结论

第四章 联苯菊酯降解菌的降解特性研究

4．1 实验材料

4．1．1 药品与试剂

4．1．2 培养基配制

4．1．3 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 唯一碳源证明实验

4．2．2 菌株的降解过程及动力学分析

4．2．3 pH对菌株降解效果的影响

4．2．4 温度对菌株降解效果的影响

4．2．5 接种量对菌株降解效果的影响

4．2．6 农药浓度对菌株降解效果的影响

4．2．7 联苯菊酯的降解途径分析

4．3 结果与分析

4．3．1 唯一碳源证明

4．3．2 菌株的降解过程及动力学分析

4．3．3 pH对菌株降解效果的影响

4．3．4 温度对菌株降解效果的影响

4．3．5 接种量对菌株降解效果的影响

4．3．6 联苯菊酯添加浓度对菌株降解效果的影响

4．3．7 联苯菊酯的降解途径分析

4．4 结论

第五章 联苯菊酯降解菌的降解活性改良

5．1 实验材料

5．1．1 测试菌种

5．1．2 药品与试剂

5．1．3 培养基配制

5．1．4 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 高浓度再驯化改良

5．2．2 紫外诱变改良

5．2．3 饥饿诱导改良

5．2．4 降解菌的降解能力测试

5．2．5 细菌表面疏水性的测定

5．3 结果与分析

5．3．1 高浓度再驯化改良

5．3．2 紫外诱变改良

5．3．3 碳饥饿诱导改良

5．4 结论

第六章 总结

6．1 结果

6．2 讨论

6．3 后续工作建议

参考文献

附图

附图1 S8的16SrDNA序列

附表

附表1 初筛各菌株生长曲线(OD570)对比

附表2 唯一碳源实验数据

附表3 降解过程与动力学分析数据

附表4 pH对降解效果的影响

附表5 温度对降解效果的影响

附表6 接种量对降解效果的影响

附表7 农药初始浓度对降解效果的影响

附表8 再驯化改良对降解效果的影响

附表9 紫外诱变改良对降解效果的影响

附表10 饥饿诱导改良对降解效果的影响

致谢

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