棉铃虫抗药性相关P450基因侧翼序列分离与转座子插入鉴定

摘要

棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)是世界性的重要经济害虫，细胞色素P450是生物体中一类重要的代谢酶类，昆虫P450介导的代谢解毒作用增强是昆虫对多种杀虫剂产生抗性的重要机制。最近的研究表明，转座子插入是P450基因过表达的一个重要机制。本文利用基因组步移获得棉铃虫多个抗性相关P450基因的基因组5'和3'侧翼序列，利用生物信息学和分子生物学方法从棉铃虫基因组中鉴定了3种新型SINE反转录转座子多个拷贝序列，其中HaSE1和HaSE2是tRNA衍生SINE转座子，HaSE3是5SrRNA衍生SINE转座子。研究结果对于明确昆虫P450基因的进化适应以及昆虫SINE转座子的分子进化具有重要意义。
　　 根据已经报道的棉铃虫抗药性相关P450基因CYP9A12、CYP9A14和CYP6AE12以及棉铃虫近缘种HelicoverpaZea抗药性相关CYP321A1基因的cDNA序列，通过genomewalking获得了多个P450基因5'和/或3'侧翼基因组序列，发现CYP6AE12基因、CYP9A14基因和CYP321A1基因的5'侧翼序列存在GATA-1、Oct-1、C/EBP、BR-CZ、CdxA和HSF等多种转录因子结合位点。这些转录因子可能在特异性调控抗性相关P450基因的表达中具有一定的作用。此外，在棉铃虫CYP6AE12基因5'侧翼序列和3'侧翼序列分别发现一个Helitron类转座子Lep1和一个SINE反转录转座子HaSE1.1的插入。
　　 对棉铃虫CYP6AE12基因的基因组5'侧翼序列的分析发现了一个新的P450基因，进一步通过RT-PCR获得了棉铃虫一个新的CYP6家族P450基因的1730bpcDNA序列，编码521个氨基酸，预测蛋白质分子量为14.35kD，等电点为4.98。该基因与CYP6AE12基因在氨基酸水平上具有74％的一致性。
　　 以通过基因组步移获得的棉铃虫CYP6AE12基因的基因组3'侧翼序列作为信息探针，应用blastn鉴定获得21个全长HaSE1拷贝序列，命名为HaSE1.2-HaSE1.22。对所有鉴定的全长HaSE1拷贝的序列分析发现，这些序列都具有典型的tRNA衍生SINE转座子的结构特征:侧翼为5-18bp的靶标位点重复(targetsiteduplication，TSD);5'端为具有Abox和Bbox（RNA聚合酶Ⅲ启动子特征性基序）的tRNA相关区;3'末端具有完整或者不完整的TGA重复。利用ClustalW进行多重序列比对获得的HaSE1一致序列长386bp，包括与黑腹果蝇tRNAArg（GenBank登录号:V00243）具有58％同源性的74bp的tRNA相关区。序列对比发现，HaSE1一致序列3'末端43bp序列与从棉铃虫BAC克隆（GenBank登录号:FP340435;位置:64987-66631）中鉴定的LINE转座子HaRTE1.1的3'末端具有82％的同源性。HaRTE1.1长1645bp，侧翼为15bp的靶标位点重复(TSD)，编码的反转录酶氨基酸序列与家蚕RTE-3-BM具有42％的一致性，3'非翻译区末端为TGA重复。
　　 以HaSE1的74bp的tRNA相关区作为信息探针，应用blastn鉴定获得7个HaSE2拷贝序列，命名为HaSE2.1-HaSE2.7。HaSE2的一致序列长286bp，5'端132bp序列与HaSE1具有94％的序列一致性，包括70bp的tRNA相关区和62bp的保守性中央区。值得注意的是，HaSE2一致序列154bp的3'端与从棉铃虫中分离的mariner类转座子Hamar1.3具有98％的序列同源性。这是第一次报道关于一个SINE家族的3'端由DNA转座子衍生而来。这很可能是由于HaSE2的反转录产物整合到mariner转座子的基因组拷贝中，也有可能是模板转换(templateswitching)过程中由于tRNA和mariner转座子的转录产物发生重组造成。
　　 应用blastn和PCR从棉铃虫基因组中鉴定和分离获得16个HaSE3拷贝，命名为HaSE3.1-HaSE3.16。序列比对表明，HaSE3的一致序列的3'端与HaSE1的一致序列的3'端具有94％的序列同源性，表明该HaSE3家族可能来源于反转座cDNA合成过程中tRNA衍生HaSE1的RNA与5SrRNA的模板转换。因此，本文的研究首次发现了昆虫的一个5SrRNA衍生SINE家族来源于5SrRNA和tRNA衍生SINE的重组。
　　 对GenBank数据库的同源检索发现，HaSE1存在于棉铃虫的两个近缘种美洲棉铃虫和烟芽夜蛾中。同样，HaSE2存在于Heliothissubflexa、烟芽夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、斜纹夜蛾和君主班蝶中，HaSE3存在于Heliothissubflexa、烟芽夜蛾、粉纹夜蛾和蓓带夜蛾中。有趣的是，尽管本文在已全基因组测序的家蚕中未发现这三种SINE家族，但却在一个非鳞翅目物种棉蚜中发现了HaSE2转座子，表明HaSE2发生了水平转移。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 昆虫细胞色素P450研究进展

1．1 细胞色素P450概述

1．2 昆虫细胞色素P450的种类多样性

1．3 昆虫细胞色素P450分布和表达的多样性

1．4 昆虫细胞色素P450的功能多样性

1．5 细胞色素P450介导昆虫抗药性

1．6 细胞色素P450与棉铃虫抗药性

2 SINE反转录转座子研究进展

2．1 转座子概述

2．2 SINEs的结构

2．3 SINEs的分布

2．4 SINEs分子标记

2．5 SINEs的功能

3 本研究意义

第二章 棉铃虫抗药性相关P450基因侧翼序列的分离

1．材料与方法

1．1 供试棉铃虫

1．2 主要试剂和仪器

1．3 棉铃虫基因组DNA和总RNA提取

1．4 引物设计与合成

1．5 基因组步移(genome walking)

1．6 RT-PCR

1．7 PCR产物克隆及测序

1．8 序列分析

2 结果与分析

2．1 棉铃虫抗药性相关P450基因CYP6AE12基因组5＇和3＇侧翼序列的分离

2．2 棉铃虫抗药性相关P450基因CYP9A14基因组5＇侧翼序列的分离及分析

2．3 棉铃虫抗药性相关P450基因CYP9A12基因组3＇侧翼序列的分离及分析

2．4 棉铃虫P450基因CYP321A1基因组5＇和3＇侧翼序列的分离

3 讨论

第三章 棉铃虫三种SINE转座子的鉴定和分子进化分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 基因组DNA提取

1．3 数据库分析

1．4 HaSE3的PCR扩增

1．5 序列和分子进化分析

2 结果与分析

2．1 棉铃虫三种新型SINEs的鉴定和分析

3 讨论

3．1 两个tRNA衍生SINE家族的保守性中央区

3．2 第一个3＇端由DNA转座子衍生来的SINE家族，HaSE2

3．3 5S rRNA和tRNA衍生SINEs重组SINEs

3．4 LINE

3．5 SINE家族在棉铃虫基因组中的分布与丰度

参考文献

致谢

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