大鼠单次全脑照射早期皮层microRNA差异表达的研究

摘要

随着医学放射技术的发展，放射技术广泛应用于医学中的诊断和治疗。在疾病诊断中，X射线检查如X线射片、数字减影血管造影(DSA)、X射线计算机断层扫描(CT)和CT血管成像等在医学实践中的应用非常普遍;在疾病治疗中，现代放射治疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，有时是唯一的手段。然而随着放射技术的不断改进及临床中广泛应用，电离辐射潜在致癌风险及放射性损伤备受关注，因此研究电离辐射致癌及放射性损伤的机理对放射学的发展有重要的意义。
　　研究发现一类新的非编码RNA—microRNA(miRNA)参与辐射诱导的生物学反应过程，研究表明辐射能在不同的组织和细胞中诱导miRNA的表达改变;miRNA在大脑的发育和功能中有很重要的作用。因此研究miRNA如何参与电离辐射引起的生物效应对揭示辐射的分子生物学机制及潜在的临床应用价值具有重要意义，miRNA有可能成为放射病诊断和治疗的潜在新靶点。
　　本研究拟探索放射性脑损伤早期miRNA的差异表达，为进一步研究提供依据。而脑组织的放射性损伤主要特征之一是血脑屏障的破坏。脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成细胞，因此本实验选择脑微血管内皮细胞模拟体外放射模型。
　　一、大鼠脑微血管内皮细胞培养的实验研究
　　目的：获取miRNA芯片所需的大鼠脑微血管内皮细胞(BMVECs)。
　　方法：采用两次酶消化法、密度梯度离心法获取BMVECs;应用vWF和GFAP免疫荧光双重标记方法进行BMVECs鉴定。
　　结果：成功在体外培养出BMVECs，免疫荧光标记为vWF标记阳性、GFAP标记阴性。
　　二、电离辐射后大鼠脑微血管内皮细胞的miRNA表达谱变化的实验研究
　　目的：观察电离辐射后BMVECs中miRNA表达的差异。
　　方法：对融合的BMVECs采用6MV-X线照射，照射剂量为10Gy，用miRNA芯片分析照射组和对照组miRNA表达差异，选取目标miRNA进行RT-qPCR验证。
　　结果：基因芯片结果中显示总共有18个miRNA在照射后发生差异表达，其中7个上调，11个下调;miR-34a上调10.8倍，miR-347上调约17.9倍，miR-106b约下调3.6倍。RT-qPCR验证显示照射组BMVECs的miR-34a、miR-347和miR-106b表达谱改变和芯片结果相符合。
　　三、大鼠单次全脑照射后早期大脑皮层miRNA表达改变的实验研究
　　目的：分别观察在0、2、10和30Gy大鼠单次全脑照射后，1天和7天时大脑皮层目标miRNA表达的改变。
　　方法：建立0、2、10和30Gy照射剂量大鼠单次全脑照射模型，分别在1天和7天时取大脑皮层，使用RT-qPCR观察miR-106b、miR-34a和miR-34表达谱改变。
　　结果：与0Gy照射组比较，照射后1天，2Gy组miR-106b表达无显著差异、miR-34a约上调6.4倍、miR-347约上调2倍;10Gy组miR-106b约下调1.7倍、miR-34a约上调5.3倍、miR-347表达无显著差异;30Gy组miR-106b约下调2.5倍、miR-34a表达无显著差异、miR-347约下调1.6倍。照射后1周，2Gy组miR-106b表达无显著差异、miR-34a约上调1.4倍、miR-347约上调2.3倍;10Gy组miR-106b表达无显著差异、miR-34a约上调2.6倍、miR-347约上调5.3倍;30Gy组miR-106b约下调1.4倍、miR-34a约上调1.8倍、miR-347约上调3.3倍。
　　结论：
　　1.通过两次酶消化法和密度梯度离心法可获得较理想的BMVECs，经vWF免疫荧光标记阳性、GFAP标记阴性。
　　2.照射后早期即发生miRNA表达谱的改变，miRNA芯片提示总共有18个miRNA在照射后发生差异表达，其中7个上调，11个下调;应用RT-qPCR对芯片结果进行验证，结果显示照射组BMVECs的miR-34a、miR-106b和miR-347表达谱改变和芯片结果相符合。
　　3.使用RT-qPCR观察大鼠大脑皮层放射后不同时间点和不同照射剂量下目标miRNA表达谱的改变，照射后miR-106b表达下调和miR-34a表达上调可能与放射性脑损伤的损伤机制相关;miR-347表达上调可能与放射性脑损伤的保护机制相关。