玉米赤霉烯酮抑制离体小鼠Leydig细胞睾酮分泌的机理研究

摘要

为揭示玉米赤霉烯酮(ZEA)抑制睾丸间质细胞(Leydig cell)分泌睾酮的分子机理，实验分别从ZEA对小鼠Leydig细胞睾酮分泌的抑制作用，ZEA对睾酮合成通路中各因素的影响作用，ZEA对细胞线粒体的损伤作用，ZEA在小鼠Leydig细胞的作用位点四个方面进行了探讨。
　　实验以原代培养的小鼠Leydig细胞为材料，用ELISA法分别测定了在hCG环境或cAMP环境下ZEA暴露浓度为0，1，5，10，20μg/mL及暴露时间为1，6，12，24h时睾酮的分泌量。用ELISA法分别测定了ZEA暴露浓度为0，1，5，10，20μg/mL及暴露时间为1，6，12，24h时胞浆内cAMP水平（hCG环境）;用化学发光标记免疫分析法(CLIA)测定其细胞表面的LH/hCG受体结合力;用Western Blot法分别测定了LH/hCG受体蛋白、雌激素受体蛋白的表达量及细胞内类固醇激素合成酶在翻译水平的表达量;用荧光定量PCR法测定了类固醇激素合成酶在转录水平的表达量;通过流式细胞术测定了其线粒体膜电位的变化。分别选取低浓度ZEA(5μg/mL)及高浓度ZEA（20μg/mL）暴露及短时间(6h)和长时间(24h) ZEA暴露的小鼠Leydig细胞，用透射电子显微镜观察了其内部超微结构，通过Western Blot法测定了细胞内孤核受体Nur77的表达情况。
　　结果表明，hCG环境中高浓度及长时间ZEA暴露对睾酮分泌的抑制效应极显著(P＜0.01)，而cAMP环境中，不同浓度及时间的ZEA暴露均可显著抑制Leydig细胞分泌睾酮(P＜0.05)，且浓度及时间-效应关系明显。不同浓度及时间的ZEA暴露对Leydig细胞LH/hCG受体的结合力及表达量的影响不显著(P＞0.05)，而低浓度及长时间ZEA暴露使胞浆内cAMP水平显著升高(P＜0.05)。不同浓度及不同时间的ZEA暴露，均可扰乱类固醇激素合成酶的活性，其中类固醇合成快速调节蛋白(StAR)的表达量随着ZEA暴露浓度的增大而呈现显著升高的趋势(P＜0.05)，而不同时间的ZEA暴露则对其表达量影响不显著(P＞0.05);3β-羟甾脱氢酶(3β-HSD)的表达量则因不同的暴露时间而不同，且呈现先降低后升高又降低的趋势。细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、细胞色素P45017α-羟化酶(P450c17a)、17β-羟甾脱氢酶(17β-HSD)的表达量则因ZEA的暴露而有不同程度的降低，且与对照组相比差异显著(P＜0.05)。不同浓度及不同时间的ZEA暴露均使小鼠Leydig细胞的线粒体膜电位呈现下降的趋势，且高浓度组（10，20μg/mL）及长时间组(6，12，24h)与对照组相比差异显著(P＜0.05)。不同浓度及时间的ZEA暴露对Leydig细胞雌激素受体的表达量影响不显著(P＞0.05)。ZEA暴露可以破坏小鼠Leydig细胞内部结构，造成线粒体空泡化及内质网的损伤，且高浓度较低浓度损伤明显，长时间较短时间损伤明显。低浓度及高浓度的ZEA暴露与短时间及长时间的ZEA暴露都极显著地抑制了Nur77的表达。
　　结论认为，ZEA与膜型雌激素受体(mER)结合，扰乱了PDEs和ACs的平衡而引起cAMP和StAR水平的上升，与核型雌激素受体(nER)结合抑制了Nur77的表达，进而抑制了类固醇合成酶基因的表达。ZEA抑制睾酮的合成是mER途径和nER途径共同作用的结果。