棉铃虫和赤拟谷盗钠离子通道基因的克隆与选择性剪接分析

摘要

电压门控钠离子通道在细胞兴奋性传导过程中具有重要作用，也是DDT、拟除虫菊酯和新型噁二嗪类杀虫剂的主要作用靶标。目前，对昆虫钠离子通道与抗药性关系的研究主要集中于昆虫对拟除虫菊酯的击倒抗性。棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是一种重要的棉花害虫，许多国家的棉铃虫都对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了严重的抗性。赤拟谷盗Tribolium castaneum是鞘翅目重要储粮害虫，也是除黑腹果蝇Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、家蚕Bombyx mori外第4个被全基因组测序的昆虫。本文克隆了棉铃虫和赤拟谷盗钠离子通道基因，并分析了其在不同发育阶段的mRNA表达水平，比较了其基因组结构和选择性剪接位点，研究结果对于进一步明确昆虫钠离子通道的结构和功能关系以及新型高效杀虫剂的创制具有重要的理论意义和实践价值。
　　通过RT-PCR技术克隆了棉铃虫和赤拟谷盗钠离子通道基因全长cDNA序列，HaNav和TcNav。HaNav开放阅读框长6168bp，编码2055个氨基酸残基;TcNav开放阅读框长6138bp，编码2045个氨基酸残基。HaNav和TcNav氨基酸序列的一致性为76％，HaNav、TcNav与黑腹果蝇钠离子通道基因para氨基酸序列的一致性都为75％。HaNav和TcNav与已知昆虫钠离子通道具有共同的结构特征，包括4个典型的同源结构域(Ⅰ-Ⅳ)，每个结构域含6个跨膜片段(S1-S6)。决定离子选择性的重要基序DEKA（分别位于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ同源结构域S5和S6连接环）在HaNav(D385，E997，K1517，A1810)和TcNav(D387，E988，K1492，A1785)中高度保守，而在钠离子通道快速失活中起着重要作用的位于同源结构域Ⅲ和Ⅳ之间的疏水性MFM基序也存在于HaNav(1584-1586)和TcNav（1559-1561）中。利用实时荧光定量PCR进一步对HaNav和TcNav的mRNA表达水平的分析发现，HaNav和TcNav在棉铃虫和赤拟谷盗不同发育阶段的表达水平存在一定差异。
　　基因组结构分析发现，HaNav和鳞翅目昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens、小菜蛾Plutellaxylostella及家蚕钠离子通道基因相似，含有33个外显子。与HaNav相比，TcNav含有26个外显孑，对应HaNav外显子8-10，22-25，30-31，32-33分别合并为一个外显子。HaNav和TcNav的外显子序列一致性为43-87％。尽管HaNav和TcNav的15个外显子长度完全相同，但两者内含子长度差异较大，HaNav的内含子平均长度是TcNav的4.7倍。除了TcNav第12内含子5'剪接位点为GC外，HaNav和TcNav内含子都具有保守的5'剪接位点GT和3'剪接位点AG。
　　对cDNA克隆的多重序列比对发现，HaNav和TcNav存在多个选择性剪接位点。在HaNav中，对应着黑腹果蝇para选择性剪接位点j、i和f，外显子2，外显子11的3'端和外显子21的5'端分别发生了外显子跳跃、选择性3'剪接和选择性5'剪接，两对互斥外显子18a/b和26a/b分别与para的c/d和l/k相对应，对应para选择性剪接位点a和b的外显子12、16的5'端存在于所有克隆中，但e和h在HaNav中未发现。在TcNav中，对应着para选择性剪接位点j和i，外显子2，外显子9的3'端分别发生了外显子跳跃、选择性3'剪接，对应para选择性剪接位点a的外显子10的5'端存在于所有克隆中，但e和h在TcNav中未发现。与HaNav和para不同的是，只有d和l存在于TcNav的cDNA和基因组序列中。此外，内含子16、17、18和19发现于TcNav的多个cDNA克隆，表明发生内含子保留。其中，内含子16导致开放阅读框架(ORF)发生变化和终止密码子的出现，内含子17、18和19没有改变ORF，但内含子19导致终止密码子的出现。