肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关基因缺失突变株的构建及其生物学特性的研究

摘要

肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)能够感染人和动物，是常见的人畜共患病原体。由SPI-1和SPI-2编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是沙门氏菌致病重要的毒力因子，不同T3SS的效应蛋白在细菌致病的各个阶段发挥不同的作用。目前对这些效应蛋白的研究主要是以鼠伤寒沙门氏菌为模型的，但它们在不同血清型沙门氏菌中的功能可能不一致。本研究选取了在肠炎沙门氏菌T3SS的6个效应蛋白基因，采用λRed同源重组法构建相应的缺失株，初步探讨了这些效应蛋白与致病性的关系，为进一步深入研究肠炎沙门氏菌感染过程中T3SS效应蛋白的分子机制奠定了基础。
　　1.肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备
　　通过PCR扩增效应蛋白SspH2、SIrP、SseL的完整基因序列，分别克隆至两种不同的原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1，构建pET-32a-SspH2、pET-32a-SIrP和pET-32a-SseL以及pGEX-6p-1-SspH2、pGEX-6p-1-SlrP和pGEX-6p-1-SseL的重组质粒，并将其转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE的结果分析，这六种重组蛋白均能够表达，并且蛋白大小与预期一致。可溶性分析结果显示，六种融合蛋白部分存在于细菌的裂解上清中。将纯化后的GST融合蛋白免疫家兔，以His标签融合蛋白为抗原的间接ELISA法检测免疫后的效价情况，结果显示三免14天后获得了针对SspH2、SlrP、SseL蛋白的高效价抗血清。
　　2.肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关基因缺失株的构建
　　以一株肠炎沙门氏菌C50041为母本，采用Red同源重组法构建SspH2、PigB、SseL、SopE2、SlrP和SipB这6个基因的缺失突变株，PCR扩增以及突变株序列测序结果证明了这6个基因突变株的构建成功。使用第一章中制备的SspH2、SlrP和SseL融合蛋白的抗血清作为一抗，通过Western-blot的方法对缺失株的这三种蛋白的表达情况进行检测，结果显示△SspH2、△SseL和△SlrP检测不到相应的效应蛋白，其它基因的缺失对这三种蛋白的表达不产生影响。细菌的生长曲线和血清杀菌结果显示，这些效应蛋白基因的缺失对细菌的生长速度无明显影响，细菌的表面结构和渗透性也未发生明显的改变。
　　3.肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白的致病作用
　　对野生株C50041和△SopE2、△SipB、△PipB、△SseL、△SspH2、△SlrP缺失株进行HeLa细胞的黏附和侵入试验以及HD11巨噬细胞内增殖试验。结果显示，与野生株和其它基因缺失株相比，△SipB缺失株的黏附和侵入能力出现了较为显著的下降，而SseL基因的缺失，使得C50041对HeLa细胞的黏附和侵入能力得以增强。巨噬细胞内增殖试验中，各组细菌的增殖率无明显变化。细菌侵入HeLa细胞后不同时间点细胞因子表达水平的结果显示，IFN-γ、TNF-α以及IL-18的表达水平差异不明显，而△SspH2在侵入HeLa细胞6h时，IL-8的表达水平显著高于野生株;△PipB在侵入HeLa细胞6h时，IL-1β的表达水平显著高于野生株C50041。1日龄雏鸡致死性试验结果显示，缺失株△SipB、△SseL和△SlrP的LD50均高于野生株C50041，其中△SipB缺失株的毒力下降最为明显;而缺失株△PipB、△SopE2和△SspH2的LD50均低于野生株C50041，特别是△SspH2缺失株的毒力增强最明显。
　　本文成功构建了肠炎沙门氏菌6个效应蛋白基因的缺失株，缺失效应蛋白SipB和SlrP可降低其毒力，缺失效应蛋白SspH2和PipB可增强其毒力，而缺失效应蛋白SseL和SopE2对其毒力无显著影响， PipB、SspH2、SseL和SopE2与已报道的在鼠伤寒沙门菌中的作用存在一定的差异。