J亚群禽白血病病毒表面糖蛋白SU和兔IGFc融合蛋白的表达及初步应用

摘要

禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)是一种能引起禽类多种类型肿瘤的反转录病毒，包括A-J等10个亚群。其中J亚群禽白血病病毒(Subgroup J of avian leukosis virus，ALV-J)是20世纪80年代末Payne等首先从肉鸡中分离鉴定出来的亚群。自1999年我国首次分离ALV-J以来，ALV-J已从肉用鸡群向蛋用型鸡群和地方品系鸡群传播。这种传播可能是因为抗原变异使ALV-J感染特性和宿主范围发生了改变。囊膜蛋白(Envelopeprotein)是决定ALV-J宿主范围的关键因素，其中表面糖蛋白gp85(SU)介导病毒与细胞受体的结合。ALV-J的SU蛋白基因序列存在不同程度变异，且变异程度较其他亚群高，这可能导致ALV-J的细胞嗜性和细胞受体种类发生变化，继而影响到病毒的宿主范围。因此，获得一种能够用于分离鉴定病毒受体的诱饵蛋白至关重要。本研究通过两种真核表达系统表达ALV-J SU和兔IgGFc融合蛋白，为ALV-J受体的研究提供工具。继而以SUJ-IgGFc融合蛋白为工具，利用免疫共沉淀方法捕获易感细胞受体蛋白，为研究细胞受体在病毒感染过程中的作用以及病毒感染的入侵机制奠定基础。
　　1.ALV-J SU和免IgG Fc融合基因在杆状病毒表达系统中的表达及其初步应用
　　为了获得ALV-J SU和兔IgG Fc的融合蛋白，用于研究ALV-J与宿主的相互作用，本研究用已构建的pcDNA3.1-SUJ-IgGFc为模板，用PCR方法扩增出SUJ-IgGFc基因，并克隆至pFastBac(1)质粒，构建转移载体pFastBac(1)-SUJ-IgGFc;再将其转化DH10BacTM感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-SUJ-IgGFc;最后在脂质体的介导下转染sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-SUJ-IgG Fc。免疫荧光试验结果显示，重组杆状病毒表达的融合蛋白可被ALV-J单抗JE9以及羊抗兔IgG全分子所识别。Western blot结果显示，表达的融合蛋白的分子量大小约95 kDa。该融合蛋白的表达为细胞表面ALV-J受体的研究提供了有力工具。
　　用常规蛋白提取法提取ALV-J易感细胞DF1的总蛋白，以纯化的SUJ-IgGFc融合蛋白为工具，应用免疫沉淀的方法捕获ALV-J受体蛋白，结果获得两种差异蛋白，经质谱分析鉴定分别为中心体蛋白(Centrosomal protein)和Ⅱ型角蛋白细胞骨架1类似物(keratin，typeⅡ cytoskeletal1-like)，二者与已报道的ALV-J受体chNHE1不相符。这一结果提示DF1细胞可能存在除NHE-1受体之外能与SU结合的蛋白。
　　2.ALV-J SU和兔IgGFc融合基因在腺病毒表达系统中的表达及其初步应用
　　鉴于昆虫细胞表达系统对表达蛋白修饰的特点，在使用杆状病毒表达载体表达某些蛋白时无法保持天然状态，可能会影响互作蛋白的识别。因此，为了获得更接近天然特性的SU-IgGFc融合蛋白，本研究将SUJ-IgGFc融合基因克隆到pShuttle-CMV中，构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-SUJ-IgGFc;将PmeⅠ线性化处理的重组质粒与pAdEasy-1共转化BJ5183-AD-1细胞，经同源重组及抗性筛选和酶切鉴定得到重组腺病毒质粒pAd-SUJ-IgGFc。再将Pac1线性化的重组腺病毒质粒转染293T细胞，得到重组腺病毒rAd-SUJ-IgGFc。经PCR鉴定证实重组腺病毒含SUJ-IgGFc基因。同时免疫荧光试验结果显示，重组腺病毒在293T细胞得到表达，且表达的融合蛋白可被ALV-J单抗JE9以及羊抗兔IgG全分子所识别。Western blot结果表明，融合蛋白分子量大小约为95 kDa，且与JE9单抗以及羊抗兔IgG全分子都有很好的反应性。以上结果证实，本研究成功构建了重组腺病毒表达载体rAd-SUJ-IgGFc，并在293T、MDCK等真核细胞中大量表达，为进一步对商品蛋鸡ALV-J受体或共受体的研究提供材料。
　　通过提取ALV-J易感细胞DF1的总蛋白，以融合蛋白SUJ-IgGFc-ProteinA结合物为工具，应用免疫沉淀的方法捕获与ALV-J SU特异性结合的蛋白，所获得的免疫沉淀蛋白经SDS-PAGE分析后得到5个差异蛋白，大小分别约为20kDa、39kDa、44kDa、80kDa、115kDa;而其是否为ALV-J受体蛋白尚有待进一步实验验证。