IPS-1在灭活仙台病毒诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡中的双重作用

摘要

实验动物的质量直接影响着动物实验的结果，决定科研成果的可重复性和科学性。仙台病毒是引起啮齿类实验动物呼吸系统疾病的主要病原。实验鼠群一旦感染该病毒很难清除，常形成隐性感染，对实验动物免疫系统、生殖繁育、致瘤作用的研究会造成严重干扰。研究表明，灭活的仙台病毒（Hemaglutinating virus of Japan Envelope，HVJ-E）不仅可以作为载体递送抗肿瘤药物，激活多重抗肿瘤免疫，同时还能直接杀伤肿瘤。本实验旨在研究HVJ-E对小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)的体内外溶瘤作用及其信号转导机制。
　　首先，我们用不同浓度的HVJ-E处理B16F10细胞，MTT法测定细胞活力;Hoechest33258荧光染色法观察凋亡细胞的核形态变化;FACS(Annexin V/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明，HVJ-E对B16F10细胞的生长有显著抑制作用，抑制效应呈剂量依赖性;HVJ-E作用B16F10细胞后，荧光显微镜下观察到典型的凋亡特征;随着HVJ-E处理浓度的增大，B16F10细胞的凋亡率升高。
　　其次，我们用不同浓度HVJ-E作用B16F10细胞后，Western blot法检测Caspase通路、MAPK通路中相关蛋白。另外，分别用Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK(40μM)、p38 MAPK抑制剂SB203580(10μM)、JNK抑制剂SP600125(2μM)和MEK1/2抑制剂U0126(4μM)预处理细胞30分钟后加入HVJ-E，Western blot法检测相关蛋白的磷酸化水平。结果表明，HVJ-E通过激活Caspase依赖的凋亡通路从而诱导B16F10细胞凋亡，其中caspase-9参与的内源性凋亡通路对该凋亡过程具有重要的作用;MAPK通路也参与了HVJ-E诱导的B16F10细胞凋亡。
　　然后，我们用不同浓度HVJ-E作用B16F10细胞，ELISA法检测HVJ-E作用后B16F10细胞的IFN-β表达量。另外，用JAK Inhibitor I（1μM）预处理B16F10细胞30分钟后加入HVJ-E，Hoechest33258荧光染色法观察细胞的核形态变化;FACS法检测细胞凋亡率;Western blot检测p-STAT1、Caspase-3以及PARP。最后，使用IFNα/βR抗体预处理B16F10细胞3小时后加入HVJ-E，Western blot检测ERK1/2、p38 MAPK、JNK的磷酸化水平。结果表明，HVJ-E作用B16F10细胞后IFN-β的表达量很少;HVJ-E对B16F10细胞的凋亡作用部分依赖IFN-I的产生;IFNα/β受体的封闭并不影响MAPK通路的活化。这些数据表明了在HVJ-E对B16F10细胞的凋亡作用中，IFN-I有重要的作用，并且它和MAPK通路的活化是独立分开的。
　　接下来，我们分析了干扰素刺激因子(IFN-promoter stimulator1，IPS-1)在HVJ-E诱导B16F10凋亡过程中所起的作用。预先向B16F10细胞中转染抑制IPS-1表达的siRNA(抑制率达90％)，再用HVJ-E作用细胞，FACS法检测细胞的凋亡率;Western blot检测p-STAT1、Caspase-3、PARP以及MAPK通路相关蛋白的表达。结果表明，IPS-1的骤减强烈抑制了HVJ-E所引起的细胞凋亡;降低了STAT1的磷酸化和caspase-3通路的激活;降低了JNK和ERK1/2的磷酸化，p38 MAPK除外。这些数据进一步说明STAT1的磷酸化以及Caspase-3通路的激活是由少量的IFN-β调节的。而IPS-1以非IFN-1依赖的方式调节MAPK通路的活化。
　　最后我们通过BALB/c裸鼠皮下接种B16F10细胞制作小鼠黑色素瘤模型。实验组小鼠每只皮下注射1×106 B16F10细胞和1×109 HVJ-E的混合液，对照组注射等量的B16F10细胞。接种后每隔一天测量荷瘤鼠的肿瘤体积，25天后制作肿瘤生长曲线。同时，另取两组荷瘤小鼠，待瘤体直径达0.5cm时，小鼠瘤内注射2×1010 HVJ-E或者PBS，3天后处死，摘取肿瘤制作石蜡切片。HE&TUNEL法分析荷瘤裸鼠肿瘤石蜡切片。结果表明，与对照组相比，实验组的肿瘤体积增长缓慢。而在HE&TUNEL染色切片，注射HVJ-E的肿瘤切片中观察到典型的凋亡细胞，细胞致密，染色质浓染。
　　本实验证明HVJ-E能诱导小鼠B16F10细胞凋亡，并呈剂量依赖性;凋亡过程与Caspase途径激活有关，并与MAPK家族成员的活化有关。同时，我们还发现IPS-1可以通过IFN-1依赖的方式和非IFN-1依赖的方式调节小鼠B16F10细胞的凋亡。最后，在BALB/c裸鼠黑色素瘤模型中，HVJ-E能显著抑制肿瘤的生长。本实验对HVJ-E诱导B16F10细胞凋亡的规律及其分子机制做了一定的阐述，并从全新角度研究了HVJ-E的溶瘤机制。