菌影疫苗和淋病奈瑟菌疫苗的制备及其免疫原性初步研究

摘要

细菌菌影(bacterial ghosts，BGs)是革兰阴性菌在噬菌体PhiX174的裂解蛋白E的作用下形成的不含核酸、核糖体及其他组分的细菌空壳。BGs在形态和结构上与天然细菌保持良好的一致性，菌体表面的脂多糖、肽聚糖等成分可作为天然佐剂，菌影的胞周间隙和细胞空壳内部可接受大量的外源物质（如DNA、药物等），细菌菌影不仅可直接作为疫苗使用，而且可作为运送疫苗和药物的载体。
　　淋病(Gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的性传播疾病。随着淋病奈瑟菌耐药菌株日趋增加，抗生素的治疗效果降低或丧失，治疗成本也大大增加。新型疫苗的研制对预防和控制淋病传播流行具有重要意义。
　　本课题起初设计是借助菌影这种新型载体，装载淋病奈瑟菌基因疫苗，但由于装载效率需要进一步完善，在此先探索了大肠杆菌和沙门氏菌菌影的制备方法，同时构建了减毒沙门氏菌介导的淋病奈瑟菌基因疫苗，并分别对其免疫原性进行了初步研究，为以后淋病疫苗的研制探路。
　　研究内容分为以下三部分:
　　一、大肠杆菌菌影的制备
　　以噬菌体PhiX174为模板，通过PCR扩增出裂解基因E和Em，将裂解基因分别插入到含有λpL/pR-cI857调控系统的pBV220和pBV220m载体中。本部分共构建了四个重组溶菌质粒，分别命名为pBV220-E、pBV220m-E、pBV220-Em和pBV220m-Em。经42℃热诱导表达裂解基因，pBV220-Em裂解效率最高，达到99％;扫描电镜和透射电镜结果显示，细菌表面有孔，细菌内容物清空形成空壳，表明已成功制备了具有完整外膜的大肠杆菌菌影。将真核表达质粒pEGFP-N1装载菌影后转染小鼠巨噬细胞，发现其转染效率不高，方法有待改进。
　　二、沙门氏菌菌影的制备及其免疫原性初步研究
　　以溶菌质粒为模板，PCR扩增温控溶菌盒(EBOX1/EBOX2)，用限制性内切酶(XhoI、Spe I)酶切后重组到pBBR1MCS2载体相应的酶切位点中。通过电转化法将构建的重组质粒转入沙门氏菌HA2中，获得的重组菌经诱导表达，pBBR1MCS2-EBOX2裂解效率达到98.67％。扫描电镜和透射电镜结果显示，肠炎沙门氏菌内容物流失形成菌影。
　　将6～8周龄的BALB/c小鼠，随机分成3组:沙门氏菌HA2菌影组（HA2-BG组）、沙门氏菌HA2灭活菌组、PBS对照组。HA2-BG组和PBS组通过口服和滴鼻免疫，HA2灭活菌组以肌肉注射的方式免疫，每两周免疫一次，共免疫3次。间接ELISA检测血清中IgG和粪便中IgA水平。结果表明，二免两周后，HA2-BG组和HA2灭活菌组血清中IgG含量显著高于PBS组(P＜0.05)，三免两周后，达到极显著(P＜0.01); HA2-BG组粪便中IgA含量在整个免疫期间均显著高于HA2灭活菌组和PBS组。说明沙门氏菌菌影具有良好的免疫原性，可激发小鼠产生特异性体液免疫应答和局部的黏膜免疫应答。
　　三、减毒沙门氏菌介导淋病奈瑟菌DNA疫苗的构建及其免疫原性初步研究
　　以淋病奈瑟菌WHO-A株基因组DNA为模板分别扩增NspA基因和PorB基因，将克隆的NspA基因和PorB基因分别与pVAX1载体连接，成功构建了重组真核表达质粒pVAX1-NspA和pVAX1-PorB。将重组质粒体外转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，RT-PCR和间接免疫荧光试验可检测出NspA基因和PorB基因在mRNA水平和蛋白水平表达。将重组真核表达质粒电转化减毒沙门氏菌SL7207，构建出重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-NspA)和SL7207(pVAX1-PorB)。将6～8周龄的BALB/c小鼠随机分为五组:SL7207(pVAX1-NspA)组、SL7207(pVAX1-PorB)组、SL7207(pVAX1-NspA)+SL7207（pVAX1-PorB）组、SL7207(pVAX1)组和PBS组，每组滴鼻口服免疫1×109 CFU，间接ELISA检测抗体。结果显示，各重组菌SL7207(pVAX1-NspA)组、SL7207(pVAX1-PorB)组、SL7207(pVAX1-NspA)+SL7207(pVAX1-PorB)组在一免两周后就能检测到血清中IgG和粪便中IgA抗体，二免和三免后，其抗体水平均显著高于SL7207(pVAX1)组和PBS组。说明减毒沙门氏菌介导的淋病奈瑟菌基因疫苗可诱导小鼠产生体液免疫应答和黏膜免疫应答。