人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

摘要

目的:建立人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离、培养及扩增的方法，观察MSCs体外培养增殖的生物学特性，并应用流式细胞术，检测细胞表型，分析鉴定MSCs的纯度。
　　方法:
　　本论文采用的主要研究方法如下:
　　(1)无菌条件下抽取骨髓液5mL，用等体积PBS稀释混匀，室温下1500rpm离心10分钟，弃去脂肪层，将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液(1.077g/mL)上面，室温2500rpm离心30分钟，吸取界面白膜状层的单个核细胞。用PBS混悬后，室温1500rpm离心10分钟，弃上清并重复洗涤2次。用含10％ FBS的LG-DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为2×105/mL，接种于底面积为25cm2培养瓶中，置于37℃、5％ CO2培养箱中进行培养。3天后首次换液，弃去悬浮细胞后，每2～3天换液一次。每日镜下观察细胞形态及生长变化，待细胞生长达80％～90％融合时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％ EDTA(1∶1，V/V)进行消化，再按1∶2比例进行传代培养，共传代三次。
　　(2) MSCs的生长曲线测定:取P3细胞，按5×104/mL浓度接种于24孔培养板培养，每天取3孔，计算平均值，连续培养8天，采用血球计数板计数法，绘制生长曲线。
　　(3)贴壁率测定:取P3细胞，按5×104/mL浓度接种于25cm2培养瓶内培养，每2小时取2瓶，消化计数，计算贴壁率，绘制贴壁率曲线。
　　(4) MSCs的表型鉴定:取P3细胞，将细胞消化吹打制成单细胞悬液，1500rpm离心5分钟，弃去上清液，用PBS重复洗涤后，调整细胞浓度为5×106/mL，各取细胞悬液100μL，分别滴加荧光标记抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、HLA-DR-PE抗体10μL，4℃避光孵育30分钟，PBS洗涤后应用流式细胞仪进行检测，确定MSCs的表面标志物的表达情况。
　　结果:
　　(1) MSCs属于骨髓中的单个核细胞，采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合可以有效分离、纯化人骨髓MSCs。细胞形态观察:细胞初接种入培养瓶时为圆形的单个核细胞，大小不一，与周围的血细胞相互混杂。培养24小时后，细胞开始出现贴壁，48～72小时细胞贴壁逐渐增多，72小时首次换液后，可见少量分散的短梭形及不规则多角形的初始贴壁细胞。第4～8天细胞生长快，呈集落样生长，可见有粗大的突起伸出，细胞形态呈梭形。第10-12天后细胞克隆进一步扩大，呈大的长梭形，培养至第14～16天时贴壁细胞可达80％～90％融合，大量贴壁细胞呈长梭状成纤维细胞样形态并列或呈漩涡状排列。传代细胞刚接种时为圆形，较大，24小时内能完全贴壁，伸展呈梭形，增殖迅速，5-7天细胞融合可达90％。细胞形态均匀，与成纤维细胞形态相似，大部分呈长梭状，排列规则。
　　(2) MSCs的生长曲线分析:细胞生长曲线呈S形，原代细胞生长比传代细胞慢。原代细胞接种后第0～3天为生长潜伏期;第4～12天为对数生长期;此后逐渐减缓，进入平台期。传代细胞培养时第1～2天细胞生长处于潜伏期，第3天开始细胞生长较快，至第6～7天达顶点，后进入平台期。
　　(3)测定贴壁率:传代后的细胞贴壁较快，4小时贴壁细胞超过50％，而12小时左右超过90％的细胞已经贴壁。
　　(4)流式细胞仪检测P3细胞显示:CD29、CD44、CD105的阳性表达率分别为99.82％、99.82％、97.38％，对CD34、HLA-DR的阳性表达率分别为4.94％、1.87％。
　　结论:
　　(1)联合采用密度梯度离心法和贴壁培养法，能获得较高纯度和活性的MSCs，是一种简便可行的方法;
　　(2)通过观察MSCs的细胞形态、生长特征以及细胞表型的表达情况，可对MSCs进行初步鉴定。