亮氨酸在奶牛乳腺中的摄取效率及其对乳蛋白合成的影响

摘要

本文主要研究了不同日粮模式对奶牛乳腺中氨基酸摄取效率的影响，并针对亮氨酸对乳蛋白合成的影响及其机制进行了研究，旨在为奶牛乳蛋白合成调控研究提供有力的依据。 试验一根据我国奶牛养殖中利用的粗饲料资源及其组成的典型日粮模式，研究了日粮类型对泌乳奶牛乳腺中氨基酸的摄取效率的影响。选取散养农户常用的秸秆日粮模式(CS2)，以及大规模养殖企业应用的全价日粮模式(MF)对奶牛进行饲养试验。连续采集奶牛阴外动脉以及乳静脉血液样本，分析不同日粮模式下奶牛乳腺中氨基酸的摄取效率。结果发现，不同日粮模式下，尽管氨基酸的供给存在差异，但是乳腺对氨基酸摄取效率不受影响。 试验二为了检测体外培养奶牛乳腺上皮细胞αs酪蛋白表达，通过免疫新西兰大白兔来制备兔抗牛αs酪蛋白多克隆抗体，为后续的Western-blot法检测αs酪蛋白表达量提供有效的实验材料。 试验三采用细胞体外分离培养技术研究亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响。培养的乳腺上皮细胞经过鉴定后发现，CSN3基因表达相对稳定，所以将CSN3作为检测的目的酪蛋白基因。用不同浓度的亮氨酸处理乳腺上皮细胞，检测CSN3的表达，结果表明浓度为118.1 mg/L-236.2mg/L时，亮氨酸对CSN3基因相对表达量的促进作用最显著。 试验四进一步检测了亮氨酸调节乳蛋白合成的机制。针对氨基酸之间存在复杂的相互作用，为了去除其他氨基酸的干扰，将培养基稀释100倍，减弱了其他氨基酸的作用且又保证细胞的健康生长。用已得到的最佳浓度的亮氨酸处理细胞，对乳蛋白合成进行检测，分别检测了κ-酪蛋白、αs酪蛋白基因及蛋白的表达。根据亮氨酸的相关研究报道，亮氨酸对蛋白质的合成调控作用是通过mTOR通路实现的。进而在添加亮氨酸的基础上又添加了mTOR上游通路阻断剂LY294002对mTOR信号通路进行阻断，从而对其机制进行探索。实验结果表明，亮氨酸能够促进κ、αs-酪蛋白以及相关基因的表达(P＜0.05)，LY294002对这种促进有一定的抑制作用。亮氨酸及LY294002对mTOR信号通路相关基因的表达也有一定的影响，但作用均不显著。亮氨酸没有促进上皮细胞的增殖，LY294002对上皮细胞增殖有显著的抑制作用(P＜0.05)

目录

摘要

缩略词汇总

第一章 文献综述

1 影响乳蛋白合成的相关因素

1．1 遗传因素对蛋白质合成的影响

1．2 营养因素对蛋白质合成的影响

1．3 管理因素对乳蛋白合成的影响

1．4 环境因素对乳蛋白合成的影响

2 氨基酸对动物的营养作用

2．1 改善血糖

2．2 免疫作用

2．3 供能

2．4 参与激素的合成与分泌

2．5 调节蛋白质的合成

3 蛋白质合成的调控机制

3．1 转录水平的调控

3．2 翻译水平的调控

4 亮氨酸对蛋白质的合成调控

4．1 亮氨酸对蛋白质合成的影响

4．2 亮氨酸代谢产物对蛋白质合成的影响

4．3 亮氨酸调节蛋白质合成机制

5 研究目的、意义和内容

5．1 研究目的和意义

5．2 研究内容

6 技术路线

第二章 不同日粮模式对泌乳奶牛乳腺中氨基酸的摄取效率的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 不同日粮模式对氨基酸的摄取效率的影响

2．2 不同时间对亮氨酸摄取效率的影响

3 讨论

4 小结

第三章 兔抗牛αs-酪蛋白多克隆抗体的制备及其应用

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 αs-酪蛋白抗体纯度

2．2 αs-酪蛋白抗体效价

2．3 αs-酪蛋白抗体特异性

3 讨论

4 小结

第四章 亮氨酸对体外培养奶牛乳腺细胞乳蛋白合成的影响

1 试验材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 体外培养上皮细胞的形态学鉴定结果

2．2 免疫组化鉴定

2．3 αs-酪蛋白检测鉴定

2．4 细胞基因稳定性检测

2．5 不同浓度亮氨酸对CSN3基因表达的影响

3 讨论

4 小结

第五章 亮氨酸对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的调节机制

1 试验材料与试验方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 亮氨酸对酪蛋白基因的影响

2．2 亮氨酸对酪蛋白表达的影响

2．3 亮氨酸对mTOR相关通路基因的影响

2．4 亮氨酸对细胞增殖的影响

3 讨论

4 小结

全文讨论与结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

声明